PCR检测猪瘟活疫苗(细胞源)中的16种外源病毒 .pdfVIP

利用荧光定量PCR和荧光定量RTPCR检

测猪瘟活疫苗（细胞源）中的16种外源

病毒

作者：孙博，宋新刚，张萌萌，张健，高习文，张立恒，尹辉，郭伟，任德强

来源：《现代畜牧科技》2019年第1期

摘要：本文为分子生物学方法检测猪瘟活疫苗（细胞源）外源病毒提供实验数据。用经过

验证的荧光定量PCR和荧光定量RT-PCR方法检测哈尔滨元亨生物药业有限公司生产的24批猪

瘟活疫苗（细胞源）中的16种外源病毒(FMDV、PCV2、CSFVW、BCoV、BVDV、BPIV3、TGEV、

PEDV、RV、PRRSV、PCV1、MRV、JEV、PPV、PRV、BHVl)，结果显示24批猪瘟活疫苗（细胞源）

成品均无以上16种外源病毒。

关键词：猪瘟活疫苗；PCR；RT-PCR；外源病毒

中图分类号：S852.4

文献标识码：A

文章编号：2095-9737(2019)01-0001-04

外源病毒的干扰，已经成为疫苗质量问题的隐形杀手，猪瘟活疫苗（细胞源）的外源病毒

检测一项，参照《中华人民共和国兽药典》（2015年版第三部）要求，需要做荧光抗体检测、

致细胞病变和红细胞吸附实验，以下简称细胞培养法。哈尔滨元亨生物药业有限公司，致力于

生产行业内最纯净的疫苗，并始终关注检测方法的研究，希望通过有效的检测手段，合理、高

效的保证产品质量。哈尔滨元亨生物药业有限公司采购了14种荧光定量PCR和荧光定量RT-

PCR商品化试剂盒，试剂盒分别经过特异性、敏感性、重复性方法学验证[2-14]，检验方法已

完成验证。现用经过验证的荧光定量PCR和荧光定量RT-PCR商品化试剂盒检测24批猪瘟活疫

苗（细胞源）中的16种外源病毒(FMDV、PCV2、CSFVW、BCoV、BVDV、BPIV3、TGEV、PEDV、

RV、PRRSV、PCV1、MRV、JEV、PPV、PRV、BHV-1)，以期为分子检测方法提供临床数据便于试验

分析及在生产过程中有针对性的防止外源病毒污染。

1材料与方法

1.1材料

分子检测试剂盒：猪细小病毒实时荧光PCR检测试剂盒，猪伪狂犬病毒实时荧光PCR检测

试剂盒，猪圆环病毒1型实时荧光PCR检测试剂盒，猪圆环病毒2型实时荧光PCR检测试剂盒，

牛疱疹病毒工型实时荧光RT-PCR检测试剂盒，口蹄疫病毒通用型实时荧光RT-PCR检测试剂盒，

猪瘟病毒野毒株实时荧光RT-PCR检测试剂盒，牛冠状病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒，牛病

毒性腹泻病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒，猪日本乙型脑炎病毒实时荧光RTPCR检测试剂盒，

猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒三重实时荧光RT-PCR检测试剂盒，高致

病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(JXAl-R株)实时荧光RT-PCR检测试剂盒，牛副流感病毒实时

荧光RT-PCR检测试剂盒，哺乳动物呼肠孤病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒（以上材料采购自

TaKaRa、Promega、青岛巴特菲生物科技有限公司、北京世纪元亨动物防疫技术有限公司）。

哈尔滨元亨生物药业有限公司连续生产的24个批次猪瘟活疫苗（细胞源）每批3瓶。荧光

定量聚合酶链反应(PCR)检测系统FQD96A(购自杭州博日科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1核酸提取

每批猪瘟活疫苗（细胞源）3瓶，用生理盐水稀释至完全溶解后混合，根据批号依次排列

顺序并标记序号。参照试剂盒说明书，进行核酸提取。

1.2.2扩增

核酸提取后扩增前将试剂盒从20℃拿出，将试剂混匀后离心待用，每种试剂盒检测26份

样品，分别为24批样品、阴性对照、阳性对照，每种检测项目配制27份体系，提取后的核酸

根据说明书要求的程序进行扩增，观察曲线，并记录CT值。PCR仪可以同时检测96份样品，

选取三种外源病毒进行同时扩增，FMDV、PCV2、CSFVW为1组，BCoV、BVDV、BPIV-3为1组，

PCV1、MRV、JEV为一组，TGEV、PEDV、RV、PRRSV为1组，PPV、PRV、BHV-1为1组，共进行

五次扩增，TGEV、PEDV、RV、PRRSV组样品数量为52个，其余每组样品数量