流式细胞术的原理和临床.ppt

为减少自发荧光，应选用较亮的荧光染料，还应使用与荧光发射光谱相匹配的光学品质优良的滤片系统。利用较长波长的光线，如染料激光器的激光做为激发光源，也可减弱自发荧光。最后，对自发荧光还可用电子线路补偿的方法将自发荧光补偿掉。第31页,共58页，星期六，2024年，5月

细胞群体的DNA直方图流式细胞计测量的结果可为一数字矩阵，此矩阵可用一个或数个图形来表示。下面我们讨论一下，一个细胞群体的DNA直方图的图形。第32页,共58页，星期六，2024年，5月设一个指数生长的细胞群体全部细胞都处于增殖状态，用细胞动力学的语言说，就是增殖比是1。细胞群体经染色后,由于每个细胞结合的染料与DNA含量成正比。由于G1期细胞的DNA含量为2C，G2和M期细胞DNA含量为4C，S期细胞的DNA含量在2C—4C之间。第33页,共58页，星期六，2024年，5月于是，从理论上说，这样一个群体的DNA直方图应该是：即G1期细胞全体都在同一荧光道上63道，G2和M期细胞则位于2*63=126道处，S期细胞位于63—126道之间，由于DNA合成速率不是均一的，因而在这一段范围内不会是均匀分布。第34页,共58页，星期六，2024年，5月第35页,共58页，星期六，2024年，5月细胞周期和DNA分布直方图

A细胞周期BDNA直方图的理论分布C实际的DNA直方图第36页,共58页，星期六，2024年，5月第37页,共58页，星期六，2024年，5月

流式细胞仪的技术指标1.荧光分辨率是表明仪器测量所能达到的最大精度，通常用变异系数表示。显然它与被其测定的标准样品有关。2.荧光灵敏度以能检测到最少的FITC分子来表示，即微球上最少标有多少个FITC分子时刚好能被检测到，即定义为荧光灵敏度。第38页,共58页，星期六，2024年，5月3．前向角散射光灵敏度以前向角散射光最小能检测到的颗粒直径表示。一般仪器能检测到的最小的直径在0.3um左右。4．前向角散射光分辨率以变异系数表示。一般约在2.0%。第39页,共58页，星期六，2024年，5月5．分析/分选速度分析速度可达每秒5000-10000个细胞，分选速度为每秒5000个细胞通过测量区。6.分选纯度分选纯度是个比较复杂的问题，它不但与仪器精度有关，而且与被分选的细胞亚群在整个群体中的相对位置也有关系。如果被分选的亚群在直方图或二维点图上可清晰地分辨出来且与其他亚群无重叠，则分选结果的纯度就高，反之就低。第40页,共58页，星期六，2024年，5月7.分选收获率定义为通过测量区应被分选的细胞如果有100个，实际落到指定收集器中的数目为95个，此称为收获率95%。一般应在90%以上。收获率与分选纯度是呈负相关。除以上7个参数外，还有样品浓度，同时可测参数、光源、喷孔尺寸、计算机配置等参数或指标。第41页,共58页，星期六，2024年，5月细胞的参量和荧光探针流式细胞术能够测量细胞的很多参量。可分为两类：一类是内部参量，指不用任何荧光探针标记就可测量的细胞参量；另一类是外部参量，指需要外加荧光探针标记的细胞参量。同时又可将细胞参量分为结构参量和功能参量，结构参量描述细胞的形态特征和化学组成，功能参量描述细胞的理化特征。这被称为细胞参量的二维分类。第42页,共58页，星期六，2024年，5月测量细胞的外部参量必须用荧光探针进行标记。荧光探针（荧光染料）是探测细胞内结构的非常灵敏的工具。第43页,共58页，星期六，2024年，5月常用的荧光素FITC异硫氰酸基荧光素488PE藻红蛋白545PI碘化丙啶490EB溴化乙啶480AO丫啶橙490TRITC四甲基若丹明554TexasRed德州红355第44页,共58页，星期六，2024年，5月参数结构功能?内部细胞大小、形状，细胞质的颗粒氧化还原状态性，色素量，蛋白荧光外部DNA量、碱基比例，染色体结构膜的完整性，通透性，酶