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太上有立德，其次有立功，其次有立言，虽久不废，此谓不朽。——《左传》
实验二植物病原菌的组织分离
实验二植物病原菌的组织分离、培养和纯化
一、实验目的
通过本次实验学习植物病原菌分离培养及纯化的原理和常用的方
法。
二、材料和用具
玉米大斑病叶、灰斑病叶、苹果果实轮纹病及霉心病、甘薯黑斑
病等材料，5%次氯酸钠溶液（有效氯为5%，见光分解，尤其紫外光，
现用现配），75%酒精，剪刀，镊子，无菌水，灭菌培养皿，保鲜膜
封口膜，记号笔、解剖刀，75%酒精小喷壶、酒精灯，打火机、、无
菌滤纸、酒精棉、培养皿
三、分离材料的选择
为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且
最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材料新鲜，污染的
可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。
四、植物病原菌的分离方法
病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有
组织分离法和稀释分离法两种。
（一）.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离，此法又
分为小块组织分离和大块组织分离两种方法。
1、病斑类病原菌的分离（玉米大斑病病、灰斑病及苹果果实轮纹
病的分离、甘薯黑斑病）
（1）将无菌培养皿、镊子、无菌水、无菌滤纸、75%酒精小喷壶
等放入无菌操作台，开紫外灯15分钟。期间融化培养基备用。
（2）在操作台外，用酒精消毒双手，晾干。在操作台内再次消毒
双手，晾干，将融化并冷却到50℃左右的PDA以无菌操作倒入培养皿
8—10ml，在桌面上轻轻摇动，敞开盖，制成平，凝固后待用。
（3）在操作台外，取分离材料，在病、健交界处剪取2—3毫米
长的病组织。
太上有立德，其次有立功，其次有立言，虽久不废，此谓不朽。——《左传》
（4）在无菌条件下，用5%的次氯酸钠溶液消毒3-5min，（时间
长短依病组织不同而异，处理种子约5—10分钟）。
（5）用经过三次火焰灭菌的镊子将消毒的病叶移至无菌水中，漂
洗3次，在滤纸上吸干水分，移至PDA平板培养基上，每皿可放均匀
放3~4片，使材料与培养基紧密接触。倒置于25—28℃恒温箱内培
养。
（6）3~4天后，待菌落长出后挑取前缘菌丝，回接于PDA培养
基上，在25℃温箱中培养，待菌落颜色变深后，在无菌条件下镜检是
否是玉米大斑病菌、灰斑病菌、黑斑病菌、轮纹病菌，若仅有这几种
病原菌的分生孢子，则说明已获得了纯培养，否则，则需要继续转至
斜面培养基上进行纯化，直至获得纯培养。在4℃冰箱中保存。
2、种子内部病原菌的分离（小麦根腐病菌的分离）
选择典型的小麦黑胚粒3—4个，在70%的酒精中浸2—3秒钟
后，以镊子夹住投入0.1%升汞溶液中表面消毒2—3分钟，然后取出
小麦粒，以灭菌水冲洗3次，再移至已倒好的马铃薯琼脂平板培养基
上，注意要以小麦的黑胚部位着靠在培养基上，倒置在25℃温箱中培
养，待菌落长出后，挑取前缘菌丝于马铃薯斜面培养基上培养，培养
3-4天后，无菌条件下镜检是否获得纯培养。
3、病组织内部病原菌的分离（大豆枯萎病菌的分离）
取大豆枯萎病病根
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