生物化学实验报告参考模板.pdfVIP

以家为家，以乡为乡，以国为国，以天下为天下。——《管子》

生物化学实验报告

实验一考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质的含量（p24）

一、目的要求

掌握考马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlue）法测定蛋白质含量原理和方法。

二、实验原理

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质─染料结合的原理，定量的测定微量蛋白

浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正

在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰G-250染料在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为

蓝色。在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由465nm变为

595nm。且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，通过测定595nm处光吸收的增加量可

知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）

和芳香族氨基酸残基相结合。

考马斯亮蓝染色法的突出优点是：

（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋

白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光

吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于

染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，

且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格

地控制时间。

（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘

油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于

不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以

减少这方面的偏差。

（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷

基硫酸钠（SDS）等。

三、材料、试剂与器具

（一）、试剂：

1、考马斯亮蓝试剂：

考马斯亮蓝G—250100mg溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%HPO，用蒸馏

34

水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%

（W/V）乙醇，8.5%（W/V）HPO。

34

2、标准蛋白质溶液：

纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同

0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。

（二）标准和待测蛋白质溶液

1．标准蛋白质溶液

纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同

0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。

2．待测蛋白质溶液。

人血清，使用前用0.15mol/LNaCl稀释200倍。

1/15

以家为家，以乡为乡，以国为国，以天