乙酰胆碱酯酶抑制剂.ppt

HPLC-UV-ESI-MS-TLC联用筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂01前言02实验03结果与讨论04结语与展望目录CONTENTS第一部分前言选题意义研究现状实验策略创新之处乙酰胆碱酯酶抑制剂是治疗老年性痴呆病的临床药物。本实验以合成的混合物为研究对象，把高效液相色谱法、质谱法以及薄层色谱法成功地应用于筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的合成产物，为寻找更多的药物信息提供了一种新的方法。1.1选题意义1.2经典研究方法先导药物合成分离提纯测定生物活性易提纯体系副产物典方法的局限性：?合易提纯体系；注重主要合成产物的信息主要合成产物难提纯体系1.3实验策略合成混合物二维TLC分离检测混合物条件优化最佳展开剂的确定最小检测量的确定测定抑制活力HPLC定量分离定量条件优化pH的影响离子对试剂的影响三乙胺的影响LC-MS定性借助氢谱结论发展了多维薄层色谱法分离同分异构体，同时在薄层板上检测其生物活性对合成过程中的副产物进行筛选，从而获得更多有用信息实现了各种色谱方法的联用合成产物的混合体系不经提纯直接进行筛选，特别适合难提纯体系1.4创新之处研究体系仪器试剂实验方法第二部分实验2.1研究体系主要合成路线氢谱图质谱图红外图谱TLCaluminiumsheetsSilicagel60F254(merck公司）可调式移液器（Thermolabsystems,0.5～10μL）1100型高效液相色谱仪（Aligent公司），配有二级管阵列检测器，化学工作站（AgilentChemStationforLC3D）液相－质谱联用仪（ThermoFinigan公司），配有ESI离子源，化学工作站2.2仪器乙酰胆碱酯酶抑制剂混合物（合成产物）乙酰胆碱酯酶（Sigma公司）氯化乙酰胆碱（Sigma公司）5，5－二巯基双－2－硝基苯甲酸（Sigma公司）2.3主要试剂010203二维薄层色谱法分离测定抑制活力HPLC分离测定混合物LC-MS定性2.4实验方法第一维：三氯甲烷：甲醇＝9：1；0.4mL0.1mol/L的三乙胺甲醇溶液；0.3mL0.1mol/L的HCl甲醇溶液；1.0mL10mmol/L的十二烷基硫酸钠甲醇溶液。流动相走过的距离为5.3cm；第二维：三氯甲烷：甲醇＝9：1，流动相走过的距离为8.0cm两维之间的干燥时间：5min1232.41二维薄层色谱法分离混合物展开剂体系取2.5μL样品溶液点板，在二维展开剂体系展开。逐次喷上氯化乙酰胆碱溶液、DTNB溶液，待硅胶板干燥后喷上新鲜的酶液。5分钟后观察现象。分别配制2～0.05mmol/L的样品溶液，依照上述方法，测定该方法的最小检测量2.42二维薄层色谱法测定抑制活力实验结果结论：用薄层色谱法可以鉴别出具有抑制能力的化合物。同时，可以粗略地测出各种化合物的抑制能力的大小。混合物经二维TLC的分离结果最小检测量的测定结果1：2mmol/L2:1mmol/L3:0.5mmol/L4:0.2mmol/L5:0.1mmol/L6:0.05mmol/L2.42高效液相色谱法分离测定混合物pH的影响条件优化结论：在不加入其它改善剂时，随着pH值的变化，面积及保留时间几乎没有什么变化；但pH越大，造成的拖尾现象越严重。因而，小的pH有利于分离。改变十二烷基苯磺酸钠溶液的浓度，按照同一梯度进行测定。观察其浓度对于分离的影响。结论：加入了离子对试剂后，各组分由于分子的空间结构不同，从而在固定相上的保留不同，进而得以分离。我们采用的十二烷基苯磺酸钠的浓度为30mmol/L离子对试剂的影响三乙胺的影响未加入三乙胺100：2100：4100：6结论：从上图可以看出三乙胺的加入可以改善峰型的拖尾。当1％甲酸－三乙胺＝100：4时，各种化合物已经基本达到分离；当继续增加三乙胺的量，分离又逐渐变差。本实验采用的1％甲酸－三乙胺的比例为100：4。色谱条件色谱柱：HypersilODS2C184.6mm×50mm5um检测波长：426nm流速：1ml/min进样量：20μL流动相：甲醇；1％甲酸－三乙胺＝100：4；30mmol/L十二烷基苯磺酸钠采用以下淋洗梯度进行分离测定梯度淋洗t/minA%B%D%020782620