克隆基因表达及基因干扰-修.pptVIP

一、大肠杆菌重组表达蛋白的分离与纯化超声波破碎离心收集上清热处理变性123654精制品的分离纯化上清用硫酸铵沉淀凝胶层析、离子交换层析粗制品的分离纯化离心收集菌体离心二、酵母重组表达蛋白的分离与纯化1.酵母细胞内表达的重组蛋白质的分离纯化以α-蛋白酶抑制剂的纯化为例：2.酵母表达分泌型重组蛋白的分离与纯化以酵母表达干扰素纯化为例：收集酵母细胞玻璃珠破碎离心取上清DEAESepharose柱层析梯度洗脱收集活性部分浓缩葡聚糖凝胶G75柱层析收集、浓缩SDS纯度鉴定发酵液用0.45μm孔径滤膜过滤浓缩DEAE-Trisacryl柱层析梯度洗脱收集干扰素部分葡聚糖凝胶G75柱层析洗脱收集干扰素稀释层析聚焦缓冲液洗脱电泳鉴定*Western印迹（Westernblotting）三、表达产物的鉴定*蛋白质样品的制备01.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)02.蛋白质的电转移(胶膜)03.三、表达产物的鉴定*靶蛋白的免疫学检测三、表达产物的鉴定*封闭 脱脂奶粉或BSA靶蛋白与第一抗体反应与第二抗体反应HRP标记显色 03040201三、表达产物的鉴定*第七章克隆基因的表达及基因干扰*010203第一节外源基因的表达第二节表达产物的分离、纯化与鉴定第三节基因表达干扰技术第三节基因表达干扰技术*核酶与脱氧核酶1小干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)2微RNA(microRNA)3反义核酸技术4一、反义核酸技术*反义RNA技术反义核酸技术的应用反义寡核苷酸技术（反义DNA技术）（一）反义寡核苷酸技术一、反义核酸技术*01020304反义寡核苷酸的作用机制反义寡核苷酸的设计与合成反义寡核苷酸的修饰反义寡核苷酸的给药途径一、反义核酸技术*反义寡核苷酸技术反义寡核苷酸的作用机制抑制mRNA的翻译抑制复制或转录抑制蛋白质的加工、修饰及功能表达一、反义核酸技术*反义寡核苷酸的设计与合成设计计算机软件预测RNA的二级结构利用寡核苷酸随机文库鉴别mRNA上的RNaseH切割位点、寡核苷酸芯片的扫描分析、随机寡核苷酸库结合逆转录分析法等对自然折叠的mRNA进行设计合成一、反义核酸技术*长度一般为15～25个核苷酸01G-C含量为60%～65%02反义寡核苷酸的修饰一、反义核酸技术*甲基修饰磷酸骨架最常见的是对ASON的骨架中的磷酸基团进行修饰硫原子代替磷酸二酯中的氧原子聚酰胺键代替磷酸骨架反义寡核苷酸的给药途径一、反义核酸技术*直接作用于培养细胞结合L-多聚赖氨酸或脂质体进入细胞动物模型则可通过静脉、腹腔、皮下、肌肉、瘤体内注射或气雾吸入等途径（二）反义RNA技术*反义RNA的设计03反义RNA的作用机制02反义核酸技术01（二）反义RNA技术1.反义RNA的作用机制(1)与引物RNA前体互补结合，抑制DNA复制(2)阻止目的mRNA的成熟及向胞浆内转运(3)抑制mRNA翻译(4)使mRNA更易被核酸酶识别而降解一、反义核酸技术*一、反义核酸技术*反义RNA的设计与ASON相比，反义RNA的设计较为简单一、反义核酸技术*（三）反义核酸技术的应用需要完善或解决的问题：①防止被核酸酶降解②需要进一步了解寡核苷酸进入细胞的确切机制③很多寡核苷酸易发生序列特异性和非序列特异性的结合④ASON是否会影响正常细胞的基因表达⑤用载体导入反义RNA在体内表达时，存在安全性和转染效率不高等问题二、核酶与脱氧核酶*核酶：能够催化RNA剪接的由RNA组成的酶。Cech与Altman分享了1989年诺贝尔化学奖。脱氧核酶：1994年Breaker发现具有催化功能的DNA分子。（一）核酶*核酶与脱氧核酶核酶的分类核酶的结构核酶的设计与修饰核酶转移方法核酶的应用二、核酶与脱氧核酶*核酶的分类核酶第Ⅰ类内含子、第Ⅱ类内含子、核糖核酸酶P大分子核酶：锤头状RNA、发夹形RNA、肝炎D病毒RNA和neurosporaVarkudsatellite核酶小分子核酶：二、核酶与脱氧核酶*核酶的结构锤头状核酶：二级结构有三个螺旋环结构区和一个催化中心除G以外的任一核苷酸