DB12T 521-2014 牛结核病噬菌体检测技术规范.docxVIP

ICS11.220

B41DB12天津市地方标准

DB12/T521—2014

牛结核病噬菌体检测技术规范

ThetechnicalstandardfordetectionofbovinetuberculosisbyMycobacteriophage

2014-04-22发布2014-07-20实施

天津市质量技术监督局发布

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DB12/T521—2014

前言

本标准的编写符合GB/T1.1-2009的要求。本标准由天津市畜牧兽医局提出。

本标准由天津市动物卫生监督所起草。

本标准主要起草人：刘子芝、赵勇、李志荣、刘纪艳、尹望中、杨建华、周永燚、王颖、赵晶。本标准于2014年4月发布。

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DB12/T521—2014

牛结核病噬菌体检测技术规范

1范围

本标准规定了噬菌体生物扩增技术检测牛结核病的定义、设备和仪器、培养基和试剂、检测、结果判定、注意事项。

本标准适用于牛结核病的疫病普查、监测和诊断。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

NY/T541动物疫病实验室检验采样方法

3定义

3.1

噬菌体Bacteriophage,简称phage

噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。

3.2

噬菌斑plaque

在人工培养基上，细菌在噬菌体的作用下裂解形成的圆形斑，称为噬菌斑。

4设备和仪器

a生物安全柜

b离心机（4000r/min）c振荡器

d水浴锅（55℃)e恒温培养箱

f有盖离心管（50mL）g无菌试管（10mL）h移液管（10mL）

i三角瓶（100mL，500mL）j平皿（90mm）

k移液器及配套吸头（100μL，1000μL）

5培养基和试剂

培养基和试剂配制方法见附录A

6检测

6.1样本的采集

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DB12/T521—2014

按照NY/T541进行样本采集。

6.2样本的处理

6.2.1牛乳

取牛乳5mL于50mL有盖离心管中，加10mL的3%NaoH溶液；振荡混匀，室温孵育15min；加灭菌完全培养基至30mL，4000r/min离心15min，弃去上清液；再加灭菌完全培养基至30mL，4000r/min离心15min后弃去上清液；加1mL灭菌完全培养基重悬沉淀物，无菌条件下转移至10mL无菌试管中。

6.2.2口鼻分泌物

取2mL牛口鼻分泌物（或2mL保存液中的牛口鼻分泌物棉拭子样品）于50mL有盖离心管中，处理方法同6.2.1。

6.3检测

6.3.1阴性对照：吸取1mL灭菌完全培养基于10mL无菌试管中，为“阴性对照”。

6.3.2阳性对照：取50μL指示细胞溶液用灭菌完全培养基稀释至1.0×106cfu/mL，取1mL稀释后的溶液于10mL无菌试管中，为“阳性对照”。

6.3.3灭菌双蒸水空白对照：灭菌双蒸水处理方法同6.2.1。

6.3.4在阳性对照、阴性对照、空白对照及样本管中分别加入100μL噬菌体D29溶液，混匀，于37℃水浴锅中孵育2h；

6.3.5上述反应管中分别加100μL杀病毒剂，充分混匀，置于室温10min；

6.3.6上述反应管中分别加8mL完全培养基，混匀；

6.3.7上述反应管中分别加1mL指示细胞溶液，混匀；

6.3.8快速将反应管中所有的内容物分别倒入相应的空的90mm的无菌平皿中；立即加8mL冷却至55℃左右的琼脂培养基于各平皿中，快速混匀，置于室温定型；

6.3.9将平皿倒置于37℃培养箱中培养，18h~24h后判读结果。

7结果判定

当阳性对照平皿中噬菌斑数目≥20个，阴性对照平皿的噬菌斑数少于10个，同时无菌双蒸水空白对照均无噬菌斑时，试验成立。受检样品平皿中出现大小不等的噬菌斑且≥20个噬菌斑，或许多噬菌斑相互融合成透明状判定