《让质粒鲜活起来》课件.pptVIP

*******************让质粒鲜活起来质粒是细菌或其他微生物细胞中的一种小型环状DNA分子。它们通常独立于细菌细胞染色体复制，可以被轻松地分离出来。课程目标了解质粒掌握质粒的结构、功能、应用等基本概念。掌握质粒技术学习质粒提取、转化、基因克隆等基本操作方法。理解质粒表达系统掌握重组蛋白的表达、分离纯化、活性检测等流程。什么是质粒独立的遗传单元质粒是细菌和一些真菌中独立于染色体之外的环形DNA分子，它能够自我复制。宿主细胞共存质粒存在于宿主细胞的细胞质中，并与宿主细胞共存，不会影响宿主细胞的正常生命活动。自主复制质粒能够自主复制，并在细胞分裂过程中传递给子代细胞，确保自身在宿主细胞中稳定存在。质粒的结构特征质粒是细菌染色体外的遗传物质，具有环状结构，并独立于细菌染色体进行复制。质粒通常包含几个重要的功能区，包括复制起点（ori）、抗生素抗性基因、多克隆位点(MCS)，以及其他调节基因等。质粒的功能复制质粒可以独立于宿主染色体复制，形成多个拷贝。复制的能力确保了质粒在细胞分裂时能传递到子代细胞中。遗传信息传递质粒可以携带特定的基因，并将其传递给宿主细胞。这些基因可以编码特定的蛋白质或调节宿主细胞的生理过程。质粒的应用11.基因克隆质粒可以作为基因克隆的载体，用于将目标基因插入质粒中进行复制和表达。22.基因表达质粒可以用于表达外源基因，例如生产药物、酶或其他生物活性分子。33.基因治疗质粒可以用于传递基因以治疗遗传性疾病或修复受损的细胞。44.生物工程质粒可用于构建转基因生物，例如提高作物产量、改善动物性状或生产生物燃料。质粒的提取方法细胞裂解使用合适的裂解缓冲液破坏细菌细胞膜，释放出细胞内物质，包括质粒DNA。去除细胞碎片通过离心将细胞碎片和蛋白质等杂质沉淀，留下含有质粒DNA的上清液。纯化质粒DNA利用质粒DNA的特性，例如大小、密度等，通过不同的方法，例如沉淀、层析等，将质粒DNA分离出来。质粒DNA纯化最后一步，通过沉淀或过滤等方法，去除残留的杂质，获得纯化的质粒DNA。质粒转化概念质粒转化将外源DNA导入宿主细胞的过程，即质粒进入细菌的过程。转化过程通过人工方法使细菌细胞处于感受态，使其能够吸收周围环境中的质粒DNA。感受态指细菌细胞在特定条件下处于可以摄取外源DNA的生理状态，通常采用化学或电击法处理。转化结果成功转化后的细菌细胞会获得质粒所携带的基因，可以表达相应的蛋白质。质粒转化的意义基因表达将外源基因导入宿主细胞，实现基因表达，例如生产药物蛋白或酶。质粒载体可以作为基因表达载体，在细胞中高效表达目的基因。基因功能研究研究基因的功能，包括基因表达调控机制、基因与疾病的关系等。质粒载体可以帮助构建基因敲除或过表达模型，用于研究特定基因的功能。质粒转化的步骤1准备感受态细胞使细菌细胞处于能够摄取外源DNA的状态2与质粒混合将准备好的感受态细胞与目的质粒混合3热休克处理将混合物短暂暴露于特定温度下，促进质粒进入细菌4恢复培养在合适的培养基中培养细菌，使转化成功的细胞生长感受态细胞的制备是质粒转化的关键步骤。制备好的感受态细胞具有更高的转化效率。热休克处理是促进质粒进入细菌的必要步骤。恢复培养的目的是让转化成功的细菌生长并表达目的基因。感受质粒的DNA片段克隆感受态细胞是能够接受外源DNA片段的细菌细胞，而质粒是环状的双链DNA分子，能够在细菌细胞中复制和表达。将质粒DNA导入感受态细胞的过程被称为转化，转化后质粒DNA能够在细菌细胞中复制，并随着细菌细胞的增殖而扩增。插入质粒的目的基因11.构建表达载体将目的基因插入质粒，构建表达载体，以便进行基因表达和蛋白生产。22.研究基因功能将目的基因插入质粒，转入细胞中进行表达，研究该基因的功能和作用机制。33.制备重组蛋白将目的基因插入质粒，构建表达载体，用于在宿主细胞中表达目的基因，并获得重组蛋白。44.基因治疗将治疗基因插入质粒，构建基因治疗载体，用于治疗遗传性疾病或其他疾病。质粒表达载体的构建1选择合适的质粒载体选择与目的基因兼容的载体，考虑宿主菌种类、表达效率、稳定性和抗生素抗性等因素。2插入启动子启动子控制目的基因的表达，选择合适的启动子，确保目的基因在宿主菌中高效表达。3添加多克隆位点多克隆位点用于插入目的基因，通常包含多种限制酶的切割位点，方便目的基因的插入。4引入终止密码子终止密码子指示蛋白质合成的终止，确保目的基因编码的蛋白质正确翻译。5构建表达载体将目的基因与启动子、终止