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实验报告聚丙烯酰胺凝胶电泳法

2SDS-

实验二聚丙烯酰胺凝胶电泳法

SDS-

（）测定蛋白质的分子量

SDS-PAGE

1原理

1.1聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理

1.1.1性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学

稳定，对pH和温度变化比较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，

没有吸附和电渗作用。通过改变浓度和交联度，可以控制孔径在广泛的范围

内变动，并且制备凝胶的重复性好。由于纯度高和不溶性，因此还适于少量

样品的制备，不致污染样品。

1.1.2制备原理

聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺

（）在催化剂的作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化

Bis

学聚合和光聚合两种。本实验是用化学聚合。化学聚合的催化剂通常多采用

过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂，最有

效的加速剂是四甲基乙二胺（）。在叔胺的催化下，

N,N,N,N-TEMED

由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反

应。叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH时，常会延长聚合时

间；分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用；一些金属也能抑制聚合；冷却可

以使聚合速度变慢。通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝

胶的性质稳定。

1.1.3凝胶浓度和交联度与孔径的关系凝胶浓度根据被分离的物质的分

子量大小确定。当分析一个未知样品时，常先用

7.5%的标准凝胶或用4~10%的凝胶梯度来试测，而后选出适宜的凝胶

浓度。凝胶的机械性能、弹性是否适中很重要，胶太软易断裂，；太硬则

脆，也易折断。

1.2SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理蛋白质分子在聚丙烯酰

胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于所带净电荷及分子的大小和形状等因

素。如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS和

巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和

形状无关。

在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中

的二硫键还原；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分

子上，形成蛋白质-SDS复合物。SDS与蛋白质的结合带来两个后果：第

一，使各种蛋白质的复合物都带上相同密度的负电荷，掩盖了不同

SDS-

种类蛋白质间原有的电荷差别，使所有的SDS-1

蛋白质复合物在电泳时都以同样的电荷／蛋白质比向正极移动；第二，

SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。这两个原因使蛋白质-

SDS复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，

而只是蛋白质分子量的函数。

选择一系列不同分子量的球形或基本呈球形的蛋白质作为标准物，使

其形成SDS复合物。把这些复合物在相同条件下进行电泳分离，分子量小

的物质泳动距离大，分子量大的物质泳动距离小。测定出相对泳动率，用相

对泳动率对蛋白质的分子量的对数作图，它们在一定范围内呈直线关系。因

此可作为标准曲线来检测样品蛋白质的分子量。

1.3染色原理

常用的染料主要有氨基黑10B、考马斯亮蓝R250、考马斯亮蓝

G250、1-苯胺基-8-萘磺酸，各有优缺点，本实验选用考马斯亮蓝R250，

它的染色灵敏度比氨基黑高5倍，尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。

2试剂与器材

2.1试剂

（号液）凝胶贮备液

2.1.11