液质联用检测人体血浆中的奥司他韦和奥司他韦羧酸.docx

液质联用检测人体血浆中的奥司他韦和奥司他韦羧酸

1.摘要采用HPLC法进行人体血浆中的奥司他韦及其活性代谢物奥司他韦羧酸浓度测定。方法:ACEExcel5C182.1*50mm色谱柱，水相：0.1%甲酸水溶液，有机相：乙腈，流速0.4mL/min，柱温为35℃。实验用样品则需要进行甲醇提取进样，监测模式为MRM，进行内标法定量分析（奥司他韦-d3/奥司他韦羧酸-d3为内标）。

结果：经验证的奥司他韦的线性定量范围为0.500ng/mL~200ng/mL，奥司他韦羧酸的线性定量范围为2.00ng/mL~800ng/mL。奥司他韦高、中、低3个浓度质控样品的平均提取回收率为95.13%、94.22%、91.89%，内标平均提取回收率为89.53%，奥司他韦羧酸高、中、低3个浓度质控样品的平均提取回收率为95.54%、95.87%、91.46%，内标平均提取回收率为88.83%，表明在本方法的定量范围内奥司他韦和奥司他韦羧酸具有足够、相对均一的提取回收率，且内标具有较高的回收率。

结论：本方法对于测定人血浆中奥司他韦和奥司他韦羧酸浓度的可靠性。

2.关键词奥司他韦和奥司他韦羧酸；流感；LC-MS/MS；血浆浓度

3.引言流行性感冒（以下简称流感）是流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，流感病毒属于正粘病毒科，为单股、负链、分节段RNA病毒。根据核蛋白和基质蛋白不同，分为甲、乙、丙、丁四型。目前感染人的主要是甲型流感病毒中的H1N1、H3N2亚型及乙型流感病毒中的Victoria和Yamagata系。甲型和乙型流感病毒每年呈季节性流行，其中甲型流感病毒可引起全球大流行。全国流感监测结果显示，每年10月我国各地陆续进入流感冬春季流行季节。流感的治疗主要包括对症治疗以及抗病毒治疗，抗病毒药物主要包括神经氨酸酶抑制剂、血凝素抑制剂、M2离子通道阻滞剂等。神经氨酸酶抑制剂对甲型、乙型流感均有效[1]。

磷酸奥司他韦是流感神经氨酸酶抑制剂，经水解转化为活性成分奥司他韦羧酸盐，抑制流感神经氨酸酶，从而阻断子代病毒颗粒的释放。该药适用于2周龄及以上的患者出现症状2天内的急性简单流感的治疗和1周岁以上人群的流感预防。推荐剂量为成人及青少年（13岁以上）每次75mg，每日2次，持续5天。???????磷酸奥司他韦是其活性代谢产物的药物前体，其活性代谢产物（奥司他韦羧酸盐）是强效的选择性的流感病毒神经氨酸酶抑制剂。神经氨酸酶是病毒表面的一种糖蛋白酶，其活性对新形成的病毒颗粒从被感染细胞中释放和感染性病毒在人体内进一步播散至关重要。同时也有报道指出神经氨酸酶对病毒进入未感染细胞也具有一定作用。

4.实验部分

4.1仪器和试药

岛津公司UPLC-30A超高效液相系统，美国应用生物系统公司TripleQuad-5500三重四级杆质谱仪，配ESI（电喷雾离子源）。盐酸奥司他韦和奥司他韦羧酸标准品，来源：TLCPharmaceuticalStandards，批号：RS210604、4496-011A3；奥司他韦-d3/奥司他韦羧酸-d3（内标），来源：TLCPharmaceuticalStandards，批号：2556-054A3、2556-098A10；乙腈（Merck），HPLC级；甲醇（Merck），HPLC级；甲酸（Dikma），HPLC级；超纯水（MilliporeMilli-Q），实验室自制。血浆由湖南益阳康雅医院提供。

4.2分析条件

液相条件：色谱柱为ACEExcel5C182.1*50mm，柱温35℃，流动相0.1%甲酸水溶液-乙腈，流速0.4mL/min，进样体积4μL。

质谱条件：ESI（电喷雾离子源），正离子检测，其中离子电压控制在5500V，去集簇电压70V，多反应检测（MRM）方式定量，奥司他韦313.2→225.1，奥司他韦羧酸285.2→138.1，奥司他韦-d3316.2→228.2，奥司他韦羧酸–d3288.3→138.1。

4.3溶液的配制

精密称取奥司他韦和奥司他韦羧酸对照品，用适量的甲醇溶解，使用校正因子，分别配制成浓度为1mg/mL的奥司他韦和奥司他韦羧酸储备液。将奥司他韦和奥司他韦羧酸依次配制成25.0/100、50.0/200、150/600、800/3200、1600/6400、6000/24000、9000/36000和10000/40000ng/mL溶液。取奥司他韦-d3和奥司他韦-d3对照品，用适量的甲醇溶解，配制成浓度为1.mg/mL的内标储备液IS-A，用甲醇溶液稀释至200/1000ng/mL的内标工作溶液IS?C[1-5]。

2.4血浆样品处理

取血浆样品490μL，加入奥司他韦和奥司他韦羧酸