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转基因小鼠技术

2基因打靶的简易程序

3优点：外源基因整合情况的可控性高可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便缺点：ES细胞系建立及培养困难维持ES细胞的未分化及多向分化潜能不易所得个体为嵌合体胚胎干细胞（ES细胞）法

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2025/1/65主要是利用反转录病毒的长末端重复序列(LTR)区域具有转录启动子活性的特点,将外源基因连接到LTR下游进行基因重组后,再包装成为高滴度病毒颗粒,去直接感染受精卵或显微注入囊胚腔中,携带外源基因的反转录病毒DNA可以整合到宿主染色体上。3、逆转录病毒感染法

63、逆转录病毒感染法优点由于反转录病毒的高效率感染和在宿主细胞DNA中的高度整合特性,大大提高基因转移的效率细菌质粒和噬菌体载体只能将目的基因运载至细菌中扩增和表达。病毒载体是较理想的真核基因工程载体缺点获得纯合体的转基因动物的机会少病毒载体构建复杂转入的外源基因的大小受到限制,10kb转入病毒自身基因的复制表达

2025/1/674、体细胞核移植法首先将目标基因转移到体外培育的动物体细胞中,筛选出阳性转基因细胞并进行繁殖,制备出供移植用的细胞核供体。然后将转基因细胞核供体移植到去核的卵母细胞中,重构胚胎经过激活和培养后,移植到代孕小鼠中1997年,英国Roslin研究所的Wilmut等利用成年绵羊乳腺上皮细胞作为核供体,成功获得了体细胞克隆绵羊多莉(Dolly),拉开了动物体细胞克隆技术的序幕。

2025/1/68显微法和克隆法效率比较1997Nature385,810–8134、体细胞核移植法

2025/1/69优点减少受体动物的数目,不需要用受体母畜来承担那些非转基因的胚胎,表现了强大的生命力。事先在细胞中进行基因转移和对阳性细胞进行筛选,简化了转基因动物生产的许多环节,节约了人力,具有很大的优越性。缺点体细胞克隆技术近年来发展势头十分迅猛,但在基础理论和实验技术上还需进一步探索。4、体细胞核移植法

2025/1/6105、精子载体法将精子与外源DNA进行预培养之后,使精子有能力携带外源基因进入卵中,受精后进行胚胎移植,这样产生的动物也会使外源基因得到表达。精子携带DNA的途径 外源DNA与精子共孵育 电穿孔导入法 脂质体转染法

2025/1/611优点基因转化方法简便,效率高动物育种不经过嵌合体,实验周期短缺点目的基因整合的随机性无法早期验证修饰事件成功率不高、效果不稳定5、精子载体法

2025/1/6126、YAC法（人工酵母染色体法）优点：克隆百万碱基对(Mbp)级的大片段外源DNA的能力,可以保证巨大基因的完整性;保证所有顺式作用因子的完整并与结构基因的位置关系不变;保证较长的外源基因片段在转基因动物研究中整合率的提高;鉴于基因的完整性,目的基因上下游的侧翼序列可以消除或减弱基因整合的位置效率。缺点：不稳定，制备工艺繁琐。

2025/1/6137、BAC法（人工细菌染色体法）建立在大肠杆菌的F因子上的BAC载体：外源DNA可300kb。F因子（F质粒）是一种“性质粒”，可转移至F-宿主细胞。100kb,近百个蛋白质。可构建BAC文库；有单一的loxp位点，利于图谱分析（借助标记loxp和cre重组酶；BAC载体两端有Sp6和T7引物序列利于测序，确定基因的染色体定位；可稳定遗传，易于操作。BAC文库：基因组酶切后100～300kbDNA+BAC?大肠杆菌

2025/1/614方法显微注射核移植胚胎干细胞逆转录病毒基因敲除精子介导优点外源基因整合效率较高，不需要载体，目的基因的长度可达100Kb转基因效率高；预测基因表达水平；可以使用定点整合技术外源DNA的整合率高；整合在生殖细胞中的比例也很高。可在整合点整合转移基因的单个拷贝；该方法简单、方便缺点精密仪器，技术操作较难，易造成宿主动物基因组的插入突变供体细胞易衰老ES细胞株不易建立，长期培养后出现分化现象；生产的转基因动物都是嵌合体插入的基因有大小限度；嵌合性很高；外源DNA在动物各种组织中的分布不均应用具有一定局限性有些结果不能重复基因转移方法的比较

2025/1/615Electroporation

2025/1/616电击仪

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2025/1/625转基因小鼠技术

---转基因小鼠在科研中的应用

2025/1/6261.7500万－1.25亿年前--人鼠始祖小鼠的历史2.19世纪--宠物鼠---实验鼠的“先驱