高考生物二轮复习讲义微专题 基因工程.docxVIP

基因工程

知识构建

1．限制酶的选择技巧

(1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶

①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶SmaⅠ。

②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙)。

(2)根据质粒的特点选择限制酶(如图)

(3)根据Ti质粒的T－DNA片段选择限制酶。图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取(假设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ)。

2．基因表达载体的构建过程(如图)

3．Cre/LoxP重组酶系统

(1)Cre重组酶：由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。

(2)LoxP序列：来源于P1噬菌体，包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。

(3)①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。

②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。

4．CRISPR/Cas9基因编辑

CRISPR/Cas9系统是细菌体内的用来对抗侵略细菌的外源DNA或噬菌体的基因编辑系统。CRISPR是成簇的、规律间隔的、短回文重复DNA序列。Cas9蛋白是一种RNA引导的DNA内切核酸酶，当细菌受到噬菌体的侵染时，噬菌体的某段DNA序列被Cas9内切酶剪切后整合到CRISPR的间隔序列区域，当相同种类的噬菌体再次侵染细菌时，转录的crRNA可以引导Cas9蛋白找到并切断噬菌体(形成平末端)释放到细菌体内的DNA，从而阻止噬菌体在细菌体内繁殖。其作用机制大体可以分为三个步骤：(1)内切酶(Cas9酶)切割噬菌体获取新的间隔序列；(2)将其引入原间隔序列并转录出crRNA；(3)crRNA和Cas9蛋白形成复合物精准切割与新间隔序列相同的基因。具体过程如图所示。

5．In－Fusion技术

In－Fusion技术即无缝克隆和组装技术，是一种新型的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。具体原理：在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In－Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。

(1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。

(2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。

真题演练

1．(2024·全国甲，38节选)质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在________________________________________________________________________

____________________________________________________________(答出两点即可)；

使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是________。

2．(2023·全国乙，38节选)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体，其模式图如图所示(箭头为GFP突变基因的转录方向)。图中①为________；②为________，其作用是________________________________________________________________________

________________________________________________________________________；

图中氨苄青霉素抗性基因是一种标记基因，其作用是____________________________________________________________