免疫学常用实验方法.pptVIP

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2025-01-09 发布于四川
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免疫学常用实验方法.ppt

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（红细胞溶解后）颗粒度细胞大小流式细胞仪数据分析非荧光信号荧光信号直方图分析点状图分析可以通过设“门”(Gate)，分析、分选感兴趣的细胞。设门分析实验对照的设计抗体的选择阴性对照：常用同型抗体对照阳性对照：单阳性对照（多色分析时用于仪器校正）实验标本的处理首选直标抗体荧光分子单细胞悬液的制备抗体浓度非特异结合的去除：洗涤和封闭4.WesternBlott5.HybridomaTechniqueMonoclonalAntibodyPreparationJerme，K?hlerandMilstein1984NobelPrizeBcellMyelomaSecreteAbClonalAclonalcelllinesecretingspecificAb?BcellMyelomaFusionBcellBcell+BcellBcell+MyelomaMyelomaMyeloma+MyelomaaliveBcell+MyelomaMyelomaMyeloma+MyelomaDNAA(氨基喋呤)HGPRT+，TK+H,次黄嘌呤T,胸腺嘧啶HGPRT-，TK-DieHGPRT-，TK-H,次黄嘌呤T,胸腺嘧啶AclonalcelllinesecretingspecificAb---HybridomaHGPRT次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthineguzninephosphoribosyltransferase)TK胸腺嘧啶激酶(Thymidinekinase)PreparingmAbsfrommurineascitesPristane(i.p.)Hybridoma(i.p.)ascitesMonoclonalantibodyELISAII.AssayforcellfunctionProliferation:Tcell,tumorcell,…Cytotoxicassay:Tcell,NKcell,…CellProliferationStimulatorsNonspecific:Mitogen:LPS,ConA,PHASuperantigen(超抗原):SEBCytokine:IL2,IL4,TNFAntibody:CD3,TCR,CD28Specific:specificantigen:破伤风类毒素，PPD(纯结核蛋白衍生物)MHC:同种异体细胞(MLR,混合淋巴细胞培养)AssayforTcellproliferation01020304053H-TdRwashStimulateAssaya.3H-TdR操作简单，重复性差AssayMechanism:MTTc.CFSEFigure15.67FollowingcellproliferationinhumanperipheralbloodlymphocytesusingtheCellTraceCFSECellProliferationKitC34554).HumanperipheralbloodlymphocyteswereharvestedandstainedwithCellTraceCFSE(carboxyfluoresceindiacetate,succinimidylester;5(6)-CFDA,SE)onDay0.AportionofthepopulationwasarrestedattheparentgenerationusingmitomycinC(redpeak).Theremainderofthesamplewasstimulatedwithphytohemagglutinina