第03章细胞生物学研究方法1ppt课件.pptxVIP

细胞生物学

研究方法;细胞生物学研究方法分类;本章内容;第一节细胞形态结构的观察方法;分辨率Resolution;（一）普通复式光学显微镜技术;4.光镜样本制作;切片观察：固定包埋

切片染色观察

;（二）相差和微分干涉显微镜技术Differential;在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处。

1.环形光阑：位于光源与聚光器之间。

2.相位板：物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。;2.用途：观察未经染色的玻片标本;微分干涉差显微镜Differential

interferencecontrastmicroscope（DIC）;明视野、相差、微分干涉反差显微镜观察到的细胞的比较;（三）荧光显微镜技术

（FluorescenceMicroscopy）;荧光显微镜及其光路图;2.荧光显微镜的结构特点;3.荧光显微镜的用途;4.荧光标记技术;如绿色荧光蛋白(GFP)的应用;（四）激光共聚焦扫描显微境Laserconfocalscanningmicroscope,LCSM;LCSMImageofaXenopusMelanophore

microtubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue);（五）荧光漂白恢复技术;（六）当代光学显微镜的

发展趋势;二、电子显微镜技术;（一）电子显微镜的基本知识;;2.电镜的分辨本领与有效放大倍数;透射式电子显微镜;1）电子照明系统

以电子束作光源，电磁场作透镜。电子束的波长短，并且波长与加速电压(通常50~120KV)的平方根成反比。

2）电磁透镜成像系统：物镜、中间镜、放大镜为中空圆柱体，由线圈调节电流大小，以次改变磁场强度。

3）真空系统：真空泵，一般分机械泵和扩散泵两级

4）记录系统：荧光屏、感光胶片

;电镜成像的原理;电镜与光镜光路图比较;（二）主要电镜制样技术;1.超薄切片技术;超薄切片技术;脱水剂的配制和脱水方法;3）包埋与聚合

包埋的目的是聚合成硬块的单体树脂，一方面要支撑样品本身的超微结构，另一方面使能切片。把具有这种特性的单体树脂称为包埋剂。

环氧树脂类包埋剂

;4）超薄切片与染色

修块制刀切片载网支持膜电子染色

醋酸双氧铀对富含有羧基和磷酰基的结构有广泛而明显的染色效果，如：脱氧核糖核酸（DNA）、蛋白质和结缔组织等。

柠檬酸铅细胞核与核蛋白颗粒对铅离子的亲和力强。

;电镜的标本制备－超薄切片技术;电镜下细胞超微结构;2.负染技术;3.冰冻蚀刻freeze-etching;冰冻蚀刻技术;;深度蚀刻技术;4.电镜三维重构技术;ATP合成酶;由X-射线晶体衍射(2.8A)所揭示的核小体三维结构（引自K.Luger等，1997）

a.通过DNA超螺旋中心轴所显示的核小体核心颗粒8个组蛋白分子的位置；b．垂直与中心轴的角度所见到的核小体核心颗粒的盘状结构；

c．半个核小体核心颗粒的示意模型，一圈DNA超螺旋（73bp）和4种核心组蛋白分子，每种组蛋白由3个α螺旋和一个伸展的N-端尾部组成。

N-端尾部有序排列，参与核小体之间的相互作用，以形成螺线管等高级结构。;5.扫描电子显微镜

（Scanningelectronmicroscope，SEM）;工作原理;;三.扫描隧道显微镜（scanningtunnelingmicroscope，STM）;原理;诺贝尔奖得主（从左到右）：电镜的发明者ErnstRuska,

扫描隧道电镜的发明者GerdBinnigHeinrichRohrer

;?装置：扫描的压电陶瓷，逼近装置，电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。

?特点：（1）分辨本领高，（侧分辨率为0.1～0.2nm，

纵分辨率可达0.001nm）；

（2）可在真空、大气、液体等多种条件下工作；

（3）非破坏性测量。

?用途：纳米生物学研究领域中的重要工具

;扫描隧道显微镜示意图;STMimage,BenzenemoleculesaccumulateatstepedgesonCu

;电镜技术的未来