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常用中药的生物鉴定
之聚合酶链式反应;页脚;聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。;少量DNA样品快速扩增amplify技术。
(inventedbyKaryMullis,wonaNobelPrizeinChemistryin1993);原理;PCR要件
模板Template
引物Primers:
SmallpiecesofDNA.
Madeupof15to30bases.?
BindstheDNAataspecificregion.
forwardandreverse正向和逆向
酶Enzyme:
TaqDNApolymerase
PCR核酸Nucleotides:
Substrate,fourdeoxyribonucleotides(A,C,G,T)
dNTP
;;;;Program
Denature95°C 5min
Denaturation变性：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA，一般加热至90－95℃,30sec
Annealing褪火：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链，55－70℃，固称其为褪火。mostimportantfactorinthePCR,45sec
Extension延伸：在Taq酶的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链,温度为70－75oC,1.5min
Finalextension72°C,5min;;;;;;;;;;;;;2x106;优点:
needverysmallamountofsample;FactorsaffecttoPCR
Mg+2concentration,
Mg+2?specificity?
0.1~5mmol/LMg+2预实验
Primer(引物)specificity
Degenerateprimer---tofindthetargetgeneinthecloselyrelatedspecies
specificity?,nonspecificproducts?;AnnealingTemperature
Toohigh noPCRproduct
Toolow muchnonspecificproduct
gradientTempPCRmachine
findthesuitableTemp
Taqpolymerasequality
Template(模板)DNAquality
;PCR产物鉴定
Agarosegelelectrophoresistocheckproduct
;AfterPCRamplification
Agarosegelelectrophoresistocheckproduct
1.5%agarosein17mlTAE(4mmthick)
5ulproductadd1ul6Xloadingdyemix
1Kbmarker2.5ul
100Vrun25-30min
EBstain10min(EB致癌物,戴手套),
photograph;
1.5
1.0
0.5
0.2
;PCR的应用
1.detectiongeneticallymodificationorganism (GMO)检测转基因生物，找出特异的基因或片段
findspecificgeneorfragment(promoter)
2.unculturedmicroorganism
3.pathogenidentification
4.detectioninsertionsequence(cloning)
;提取模板;乌梢蛇为《中国药典》(2010版)一部收载的一种常用中药，来源于游蛇科动物乌梢蛇[Zaocysdhumnades(Cantor)]的干燥体。有祛风、通络、止痉之功效
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