DB33T 2247-2020 鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法　　.docxVIP

ICS65.020.30B43

DB33

浙江省地方标准

DB33/T2247—2020

鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法

MethodofRT-PCRandthereal-timeRT-PCRforthedetectionofducktembusuvirusdisease

2020-03-03发布2020-04-03实施

浙江省市场监督管理局发布

DB33/T2247—2020

I

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则编写。

本标准由浙江省农业农村厅提出。

本标准由浙江省畜牧兽医和饲料标准化技术委员会归口。

本标准起草单位：浙江省动物疫病预防控制中心、浙江省农业科学院畜牧兽医研究所。

本标准主要起草人：云涛、徐辉、周彩琴、张存、赵灵燕、余斌、吴赟竑、张传亮、吴雪军、黄晓兵、冯肖肖、华炯钢、吕见涛、张娟敏、鲍伟华。

DB33/T2247—2020

1

鸭坦布苏病毒RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR检测方法

1范围

本标准规定了鸭坦布苏病毒的反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）和实时荧光定量RT-PCR的实验条件、操作步骤和结果判定等要求。

本标准适用于鸭坦布苏病毒核酸的检测。

2术语和定义

2.1

鸭坦布苏病毒（DuckTembusuVirus，DTMUV）

属于黄病毒科、黄病毒属、蚊媒病毒类、Ntaya病毒群，可引起鸭、鹅产蛋下降，雏鸭、雏鹅发病死亡。

3实验条件

3.1主要仪器设备

3.1.1PCR仪。

3.1.2荧光定量PCR仪。

3.1.3微量移液器。

3.1.4组织匀浆器。

3.1.5电泳仪。

3.1.6电泳槽。

3.1.7水浴锅。

3.1.8紫外凝胶成像系统。

3.1.9高速台式低温离心机。

3.1.10生物安全柜。

3.2试剂

3.2.10.01M磷酸盐缓冲液（0.01mol/L，pH7.4PBS）：称取8.0gNaCl、0.2gKCl、2.9gNa2HPO4?12H2O、0.2gKH2PO4，将上述试剂溶于800mL去离子水中，充分搅拌溶解，滴加浓盐酸将pH调节至7.4，然

后加去离子水定容至1L，高温灭菌30min，室温保存。

3.2.2氯仿。

3.2.3异丙醇。

3.2.4焦炭酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌去离子水：用DEPC50μL，加超纯水至100mL，室温过夜，121℃高压灭菌15min，分装到1.5mLDEPC处理过的离心管，冻存备用。

3.2.575%乙醇：取新开启的无水乙醇75mL，加DEPC水至100mL，混匀，-20℃预冷。

DB33/T2247—2020

2

3.2.6溴化乙锭（EB）：取1.0g溴化乙锭，加去离子水，定容至100mL。充分溶解后的溴乙锭溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存，其工作浓度为0.5μg/mL。

3.2.71×TAE缓冲液：取242g羟基甲基氨基甲烷（Tris）、37.2g二水乙二铵四乙酸二钠、57.1mL冰乙酸，加去离子水定容至1L，配置成50×TAE电泳缓冲液；量取20mL的50×TAE电泳缓冲液，加入去离子水定容至1L，室温保存。

3.2.81%琼脂糖凝胶：称取1.0g琼脂糖，加入1×TAE电泳缓冲液100mL，轻轻混匀后加热，使琼脂糖完全熔化。待琼脂糖胶冷至50℃~60℃时，加EB溶液（终浓度0.5μg/mL）或5μL核酸染料，摇匀后倒入制胶板中，厚度为3mm～5mm，室温凝固后取下电泳梳子，备用。

3.2.9DNA相对分子质量标准物Marker：DL2000。

3.2.1010×加样缓冲液：称取25g聚蔗糖、0.1g溴酚蓝、0.1g二甲苯青，加入灭菌双蒸水定容至

100mL。

3.2.11商品化的一步法实时荧光RT-PCR反应试剂盒。OneStepPrimeScript?RT-PCRKit（PerfectRealTime，TAKARA)，含有RT-PCR缓冲液，酶混合物，dNTP混合物，无RNA酶的水等。

3.2.12M-MLV反转录酶。

3.2.13RNA酶抑制剂。

3.2.14TaqDNA聚合酶。

3.2.15dNTPs。

3.