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臣心一片磁针石，不指南方不肯休。——文天祥

植物基因功能研究的主要方法

随着植物基因组计划的实施和完成，大量的基因组数据库和EST数据库得以建立和完成，因

此产生的问题是成千上万新基因的功能有待分子生物学家鉴定。研究植物基因功能主要有两

种策略：正向遗传学和反向遗传学策略。正向遗传学是传统的方法，策略是通过筛选天然或

人工产生的突变体进而克隆相关目标基因，即从功能（表型）－突变体－基因，最后得到具

有相关功能（如对干旱敏感或耐旱）的基因，常用手段是图位克隆并结合一些基因差异表达

筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）。反向遗传学的策略是从已知的基

因序列入手鉴定其功能，研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除、基

因激活等。采用反向遗传学鉴定基因功能是基因组计划由结构基因组学过渡到功能基因组学

的必然要求。

目前，植物抗逆性功能基因的研究策略主要集中在利用差减杂交、差异显示PCR、差异显示

分析、cDNA微阵列（或基因芯片）等技术筛选与逆境胁迫相关的表达序列标签（EST）或转

录因子，然后利用反向遗传学等技术对转录因子的功能进行研究。正向遗传学手段主要集中

在抗逆性状的遗传分析和QTL定位方面，然而目前尚无抗逆性状QTL基因克隆的报道；通过

突变体抗逆筛选的途径主要是在模式植物拟南芥中，特别是克隆了一大批与ABA合成或ABA

敏感性有关的基因，例如ABA不敏感的abi8突变体(Brocard-Giffordetal.,2004)。近年

来许多国家（特别是我国）的水稻突变体数量剧增，为通过抗逆筛选克隆基因奠定了基础。

综合利用这些研究手段可以全面地了解植物对胁迫响应的复杂机制和相互作用以及相应的信

号传导途径，从而为更加高效地利用基因工程技术来提高植物的抗逆性奠定基础。下面就几

种常见的研究抗逆基因功能的策略作简要介绍。

1.超量表达（Over-expression）

超量表达是指将目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异型启动子融合，通过转化获

得该基因产物大量积累的植株，从而扩大该基因在生理生化过程中的效应，这部分扩大的效

应带来的与正常植株在各种表型上的差异有助于帮助理解基因功能。重要逆境调控基因微小

的表达变化就可以引起下游基因的积累效应，有可能使生物体表型发生可评估的变化，使其

功能凸现。超量表达的技术规范已经相当成熟，与RNAi相比，目的基因超量表达后的表达量

更易检测，但其与反义抑制和共抑制一样，均会导致转基因植株的致死效应或强烈的多重效

应。

目前所常用的超量表达载体可以分成组成型和诱导型两种。基因诱导表达可以实现基因表达

的空间控制、时间控制和数量控制，从而避免了组成型超量表达带来的麻烦。在非诱导条件

下，诱导表达载体所转化的基因不表达或表达产物没有活性，不会干扰植物的正常发育，也

不会导致多重效应。一旦诱导，基因迅速表达或基因产物被激活，并在一定时间内保持稳定。

在植物体内，诱导信号易于察觉，接受。通过此方法，已成功研究了一系列植物基因的功能，

如将逆境应答信号途径中的基因转化植物，不仅可以通过表型差异鉴定基因功能，还可以提

高植物的抗逆性，用于遗传改良。

2.RNA干扰（RNAi）

RNA干扰现象的机制是生物学研究的热点之一，其技术也被用于高通量地研究基因功能。Fire

等证实dsRNA在体内RNase作用下将dsRNA降解成21－25nt的片段，这些小片段与内源mRNA

结合后，可由RNase高效降解，表现出基因敲除的特性，且可传递给子代，这一现象叫RNA

interference(Fireetal.,1998)。在细胞内同时表达同一基因序列senseRNA和antisense

RNA所形成的双链RNA，dsRNA进入组织或细胞诱导内源序列特异的RNA降解的机制，从而高

效抑制目标基因的表达(ChuangandMey