实用电子显微镜技术.pptVIP

直接取样离心提纯浓缩取样某些病毒性疱疹，如天花、水痘及疱疹等，可用毛细吸管直接刺入疱疹中取样。感染病毒的植物组织可采取将叶或茎切开，将液汁直接滴到带有支持膜载网上。生长在固体培养基上的微生物，可先用铂金环将其刮下，然后用缓冲生理盐水将刮下的微生物稀释成适当浓度的悬液，即可进行滴样。用于细菌、病毒、噬菌体等微生物或细胞匀浆中线粒体、微管等细胞器的提纯。先用低速离心（3000转／分），弃去较大杂质和细胞碎片，再用适当孔径的滤膜过滤，其滤液再经低温超速离心，最后取沉淀物制成悬液滴样染色。若提高电镜下观察病毒的效果，除了要求所观察病毒有较高纯度外，还要使其有适当浓度。为此，需对病毒样品进行浓缩，采用方法通常有以下几种：取样方式红细胞吸附法主要用于粘液病毒和副粘液病毒的制备。其操作方法为：将病毒悬液与等量红细胞混合，放置5分钟，使病毒吸附于红细胞表面；而后，以800转／分速度低速离心15分钟，使吸附有大量病毒的红细胞沉于管底；最后，弃去上清液，加入少量生理盐水，于室温下或冰箱中存放3～4小时，病毒即可从红细胞表面释放到上面的溶液里，取溶液滴在铜网载膜上，进行后染色处理。1低渗释放法从培养瓶中刮下所培养的腺病毒或疱疹病毒，低速离心，弃上清液，于沉淀物中加入培养液与蒸馏水的混合液（比例为1:4），使细胞因低渗破裂而释放出病毒，然后快速冻融数次，再将冻融后的悬液低速离心，取其上清液滴膜染色。2抗体一病毒凝集沉淀法某些病毒如鼻病毒、风疹病毒、小儿腹泻轮状病毒及甲、乙型肝炎抗原等，可与相应的抗体形成病毒一抗体复合物，经离心沉淀而浓缩，而后取浓缩的沉淀物滴膜染色，可找到较多的病毒。目前这一技术已广泛用于病毒疾病的快速诊断。3支持膜在电镜下观察负染色样品，如需放大倍数较高，即在高倍下才能观察到样品结构时，应该用大约5-10nm厚的碳膜或微筛膜。当不需要很高倍数时，也可采用在方华膜上喷碳方法制成支持膜，厚度不应超过30nm。滴染法第三节负染色操作方法将制备好的悬浮液样品，用毛细吸管吸取，滴于带有支持膜的铜网上。根据悬液内样品的浓度，立即或放置数分钟后，用滤纸从液珠边缘吸去多余液体，即可滴上染液，染色时间1～2分钟。而后即可用滤纸吸去染液，待干燥后即可电镜观察。注意事项：（1）操作时吸管不能离铜网太近，应让液滴离开吸管后自然滴下，否则液滴易将铜网吸起；（2）支持膜应完好无损，吸管不能太粗，液滴不能太大，否则都不能形成良好的液珠；（3）病毒的边缘分布较多，操作时不宜用滤纸吸干，而任其自然稍干后再加染液。漂浮法先将样品悬浮液滴在干燥的载玻片上，再把带有支持膜的铜网放在悬浮液的液珠上漂浮以沾取样品：然后，用滤纸吸干铜网上的多余悬液，再将铜网在染液滴珠漂浮，时间1－2分钟，最后再用滤纸将染液吸干即可观察。悬浮液与染液的pH值对负染效果有着明显影响，一般应使悬液呈中性或略偏酸性为宜（pH6.7～7.2）。为了确保悬液有足够的缓冲条件，多采用2％醋酸铵、碳酸铵溶液或其他缓冲液作为悬浮样品的稀释液。特别是磷钨酸染液的pH对病毒染色的影响更为显著，较酸的染液对病毒负染可产生较好的效果，而染液越是偏碱，其染色效果越差。染液的酸碱度不仅可影响染液的扩散，而且也会影响到病毒的结构。控制pH值掌握染色时机染色应在铜网上的悬液将要干燥而又没完全干燥时进行，如果铜网上的悬液残留较多或完全干燥后染色，则严童影响染色效果，便得不到理想的负染电镜图像。第四节影响负染效果的有关因素样品的纯度和浓度样品的纯度和浓度对负染均有明显影响，如果负染样品含杂质太多（如大量的细胞碎片、培养基残渣及盐类结晶等），会对负染色效果产生干扰，因此，样品在负染前要适当纯化。此外，悬液中的样品浓度要适当，浓度太稀时，会造成电镜下找不到样品或寻找困难；样品太浓时，会造成样品堆积而影响观察，因此，要求滴样时应做各种稀释度的对比观察。在进行负染时，经常发生颗粒悬浮样品的凝集现像。此时，染色剂与样品形成电子不能穿过的团块，致使无法看清样品的微细结构。造成上述现象的主要原因，是悬浮样品不易在铜网上展开而形成的一种团聚现象。为了促进悬浮样品的均匀分散性，以提高负染色效果，现在多采用分散剂或湿润剂，这种物质可以促使颗料性悬液在铜网上扩散。常用的有牛血清肉蛋白（BSA）、杆菌肽、二甲基亚砜（DMSO）、甘油丙二醇、十八（碳）烷等。其中，牛血清白蛋白配成0.005～0.05%的浓度，以0.5ml的样品内加入3～4滴为宜，或直接用0.01%的BSA作为离心沉淀物的稀释液。杆菌肽配成30～50μg／ml水溶液，用于稀释沉淀的颗粒标本，或按适当比例加入悬浮样品内。l％二甲基亚砜溶液加入染液中，具有加强染液穿透力和扩散作用。0102样品的均