《木麻黄青枯菌强致病性菌株筛选技术规程》.docxVIP

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木麻黄青枯菌强致病性菌株筛选技术规程

1范围

本文件规定了木麻黄青枯菌（Ralstoniasolanacearum）分离与纯化、检测鉴定方法、菌株鉴定、强致病性菌株筛选及菌种保存等技术要求。

本文件适用于木麻黄属植物强致病性青枯菌菌株的筛选。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，凡是注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB4789.28-2013食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求

3术语与定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

青枯菌Ralstoniasolanacearum

病害英文名：BacterialwiltofCasuarina；属细菌界Bacteria，变形菌门Proteobacteria，β-变形菌纲Betaproteobacteria，伯克氏菌目Burkholderiales，伯克氏菌科Burkholderiaceae，青枯菌属Ralstonia。

病原菌通过根部从病株蔓延至健株，通过土壤、水流进行远距离传播。

木麻黄青枯菌的其他信息参见附录A。

3.2

强致病性Strongpathogenicability

能让木麻黄植株迅速感病死亡的能力。

3.3

褐梗小枝Brownlignifiedtwigs

基径2mm～5mm的褐色木质化小枝，具多分枝。

3.4

分枝Branch

生长在小枝上的绿色枝条。

3.5

小苗seedling

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无性系苗或实生苗，50cm～70cm高。

4原理与方法

青枯病菌菌株间存在着显著的致病性差异，且在木麻黄—青枯菌的病理系统中，木麻黄同时存在水平抗性与垂直抗性，利用不同接种方法、不同抗性植物材料与多菌株交互接种测定的方法，才能准确筛选出强致病性菌株。

5仪器用具

5.1仪器

植物生长培养箱、恒温培养箱、恒温振荡培养箱、电子天平（精度≤0.0001g）、生物显微镜（具照相系统）、超净工作台、高压灭菌锅、高速冷冻离心机(≥12000r/min）、PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、离心机、恒温水浴锅（30℃~95℃)、低温冰箱、纯水机、涡旋振荡器、分光光度计、可调微量加样器等。

5.2用具

镊子、手术剪、解剖刀、量筒、烧杯、培养皿、三角瓶、离心管、试管、接种针、接种环等。

6培养基与试剂

6.1培养基

CPG培养基：按附录B中的B.1规定执行。

TTC培养基：按附录B中的B.2规定执行。

6.2试剂

革兰氏染色试剂：按附录B中的B.3规定执行。

PCR检测所需试剂：按附录B中的B.4规定执行。

2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）

7病菌分离与纯化

7.1病株判断

小枝黄化，稀疏、凋落，枯枝枯梢多；根系发黑腐烂；木质部局部或全部变褐色至黑褐色；树皮常纵裂成溃疡状；坏死根茎有水浸臭味；根、主茎、侧枝横切面伤口有乳白色至黄褐色的细菌脓液溢出。

7.2样本采集

挖出病根，剪取直径0.5cm～1.5cm、木质部呈水渍状或半透明状主根或侧根2段～3段，每段10cm~20cm，封口袋封装，记录采集时间、地点，带回实验室分离病菌。

7.3病菌分离

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7.3.1稀释分离法

取病根（约3cm），自来水洗净，75％的酒精浸泡消毒30s，置无菌水冲洗3次，每次30s，在超净工作台上剥去外皮，置于无菌培养皿中切除两端，最后将其横切成3份～5份，放入含有5ml～10ml无菌水的培养皿内30min，搅拌形成病菌悬浮液。用接种环蘸取菌液在TTC培养基平板上划线分离，至少3个平板，编号，于30℃下恒温培养24h～48h。

7.3.2根系溢出法

将8cm～10cm长的病根洗净，两端切成平整的新鲜断面，把其中一端浸泡于装有无菌水中的玻璃瓶中，室温放置12h～36h后，在病根的另一端断面会流出乳白色的菌脓。用接种针挑取菌脓划线培养于TTC培养基平板上，至少3个平板，编号，置于30℃下恒温培养24h～48h。

7.4病菌纯化

在培养皿内挑取不规则圆形，乳白色、中心部位粉红色，具有流动性的单菌落，接种于TTC培养基平板上，30℃条件下扩大培养36h～48h，每个菌落接种3个培养皿并编号。

7.5病菌培养

7.5.1固体培养

接种于TTC或CPG固体培养基中，30℃条件下培养24h～48h。