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蛋白质和酶的分离纯化及鉴定

蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。要研究蛋白质，首先要得到高度纯化的目的蛋白。蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白，就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。

目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法，但是酶的活性受到多种因素的影响，因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。

一、质分离纯化的一般原则

1.原料的选择

原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。

蛋白分布：体液、组织、细胞定位

2.破碎方法：

(1)机械方法：通过机械运动产生的剪切力的作用，使细胞或组织破碎的方法。

如：捣碎法、研磨、匀桨法

(2)物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。

如：反复冻融、渗透压、超声破碎

(3)化学方法：通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法.

如：甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Tween）

(4)酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等

3.目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法

4.先粗后细，分级分离

粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。如:盐析、离心、有机溶剂沉淀等。

精制：利用蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如:离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。

5.避免蛋白质的变性（pH、适合的温度和缓冲体系等）

二、常用的蛋白质的分离纯化技术

可以根据各种蛋白质的结构、理化性质不同设计分离方法。

（一）根据蛋白质的溶解度不同进行分离

1.蛋白质盐析

蛋白质属于生物大分子之一，分子量从1万至100万之巨，其分子的直径可达1-100nm，为胶粒范围之内。蛋白质的表面电荷和水化膜是其主要的稳定性因素。

大多数蛋白质都溶于水，在低盐条件下，蛋白的溶解度随着盐浓度的升高而增加，这称为蛋白质的盐溶现象，而盐浓度达到一定以后，蛋白质水化膜被破坏，电荷被中和，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的升高而降低，并且析出，这就是盐析现象。

由于各种蛋白质分子的颗粒大小和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。

常用的中性盐：硫酸铵、醋酸钠、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。

其中最常用的是硫酸铵，它的优点是温度系数小，溶解度高（25℃时的饱和度为4.1mol/L，即767g/L；0℃时的饱和度为3.9mol/L，即676g/L）；在这一溶解度范围内，许多蛋白都可以盐析出来；另外，硫酸铵不容易引起蛋白质变性；不同浓度硫酸铵pH在4.5-5.5之间，可以结合等电点进行分离纯化，沉淀效果更好。

影响盐析的因素：①温度：②pH：③蛋白质浓度：

盐析的缺点是蛋白质沉淀后要除盐，否则会影响后续的电泳或离子交换等相关实验。

2.等电点沉淀法

蛋白质在等电点时，也就是静电荷为零时，蛋白质颗粒之间的静电排斥力减小，蛋白的溶解度下降，容易发生沉淀，因此，可以调节溶液的pH，使其达到目的蛋白的等电点，使之沉淀而分离。但是，此方法很少单独应用，一般与盐析法或后述的有机溶剂沉淀法联合应用效果更好。

3.有机溶剂沉淀法

有机溶剂可使溶液的介电常数降低，蛋白之间的静电引力增大，互相吸引而易于集聚；也可使水化膜破坏，蛋白的溶解度降低。

优点：易于进一步的分离，不用脱盐

缺点：易引起蛋白的变性，所以沉淀后要尽快的分离

常用的有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。

（二）根据蛋白质分子大小进行分离

1.透析与超滤

透析就是利用透析膜将分子大小不同的蛋白质分开。超滤是利用压力和离心力，促使大小不等的分子通过滤过膜，两者都是根据化合物的分子量进行分离的一种方法，可选择不同孔径的滤膜截留不同分子量的蛋白质。

2.凝胶过滤法

是以各种多孔凝胶为固定相，对不同分子量的组分进行分离的一种层析方法。也叫凝胶

实验一?-球蛋白的分离纯化

一、实验目的

掌握蛋白质分离纯化的基本方法和步骤。

二、原理

γ-球蛋白是一组结构相似但又有差异的蛋白质，统称为免疫球蛋白（immunoglobin,Ig）。按其结构和免疫化学性质的差异分为五类。分别为IgG，IgA，IgM，IgD，IgE，其中IgG占70%。

血清中有70余种蛋白