生化反应工程酶促反应动力学.pptVIP

定义：将酶利用共价键或离子键、物理吸附等方法结合于不溶性载体上的固定化方法。01按载体结合形式分为：02共价键结合法离子键结合法物理吸附法031.载体结合法制备固定化酶载体结合法——共价键结合法酶与不溶于水的载体以共价键形式结合制备固定化酶的方法。即，通过化学共价键，把与酶蛋白活性无关的氨基酸功能基团连接在不溶于水的载体上。优缺点：优点：酶与载体结合较牢固，不易脱落，有利于长时间使用。缺点：制备条件复杂，酶蛋白活性中心易破坏。载体结合法——离子键结合法优点：操作简便，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心不易破坏，有利于制备高活性酶。缺点：载体与酶的结合力较弱，在高离子强度下酶易从载体上脱落。优缺点：常用载体：纤维素的衍生物，离子交换树脂。酶与具有离子交换基团的不溶性载体结合形成固定化酶。载体结合法——物理吸附法无机物：活性炭、白陶土、氧化铝、多孔玻璃、硅胶、碳酸钙凝胶。有机物高分子化合物：淀粉麸质、大孔树脂、DEAE纤维素、DEAE葡聚糖凝胶。通过物理吸附或静电引力将酶吸附在活性炭、氧化铝、离子交换树脂等具有活泼表面的载体上。常用载体：1优缺点：优点：酶蛋白活性中心不易被破坏，完整保持酶的高级结构；方法简单，成本低。缺点：酶吸附不牢固，易脱落；防止吸附的酶蛋白质与载体发生变性反应。2定义：将酶包埋在凝胶的微细格子中或被半透性的聚合膜所包埋，使酶分子不能从凝胶的网络中漏出，而小分子的底物和产物可自由通过凝胶网络的固定化方法。包埋方法有两种：格子型微胶囊型2.包埋法制备固定化酶包埋法——格子型固定化酶原理：以丙烯酰胺、硅胶、淀粉琼脂等材料，在酶存在下聚合成凝胶，酶被包埋在聚合物的细小多孔的网状格子中。包埋法——微型胶囊法原理：把酶包在超薄半透性的聚合物膜中，制成球状含酶微型胶囊。微囊直径几微米～几百微米。低分子底物可以自由通过并进入微囊内。与酶反应后的生成物被排除在微囊外，酶本身是高分子物质不能通过微囊而被留在微囊中，外部的蛋白分解酶、抗体等高分子物质也无法进入微囊内。特点：包埋法——微型胶囊法定义：双功能试剂或多功能试剂与酶蛋白质中的氨基酸残基作用，使酶与酶之间交联成网，凝集成固定化酶的方法。发生作用的氨基酸残基：：酪氨酸的酚基半胱氨酸的巯基N－末端的a－氨基常用的双功能或多功能试剂：：戊二醛聚甲叉双碘乙酰胺双重氮联苯胺3.交联法制备固定化酶反应体系中酶量守恒：(3)由前面的公式(2)得：代入公式(3),变换后得：(4)(5)代入公式(1),变换后得：式中：rp,max=k2[E0]:最大反应速率如果酶的量发生改变，最大反应速率相应改变。KS=k-1/k1:解离常数，饱和常数低KS值意味着酶与底物结合力越强。(6)稳态学说稳态学说的几点假设条件：底物浓度[S]远大于酶的浓度[E]，因此[ES]的形成不会降低底物浓度[S]，底物浓度以初始浓度计算。在反应的初始阶段，产物浓度很低，P+E→ES这个可逆反应的速率极小，可以忽略不计。[ES]的生成速率与其解离速率相等，其浓度不随时间而变化。＋k1k-1ESES＋Ek2P当反应系统中[ES]的生成速率与分解速率相等时，[ES]浓度保持不变的状态称为稳态。Experimentaldatademonstratedtheconcentrationprofiles.根据稳态假说，由于[S][E0]，所以[S][ES],[S]-[ES]≈[S](Km米氏常数)式中：1当[S]Km时，，属一级反应。2当[S]Km时，，属零级反应。3当[S]＝Km时，。对米氏方程的讨论：米氏常数Km的意义Km值代表反应速率达到rpmax/2时的底物浓度。Km是酶的一个特性常数，Km的大小只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。但底物种类、反应温度、pH和离子强度等因素会影响Km值。因此可以用Km值来鉴别酶。vrmax/2Km[S]快速平衡稳态假设①不考虑逆反应的存在。即：②ES在反应开始后与E及S迅速达到动态平衡。②ES的生成速率与其解离速率相等，其浓度不随而变化。③底物浓度远高于酶的浓度