《分子克隆实验设计》课件.pptVIP

*****************实验目标基因克隆从生物样本中分离目标DNA片段,并将其克隆到载体中进行扩增。蛋白表达通过遗传工程技术在宿主细胞中高效表达目标蛋白。蛋白纯化从表达系统中分离提取并纯化所需的重组蛋白。实验原理DNA双螺旋结构分子克隆实验以DNA为目标物质,DNA双螺旋结构中蕴含遗传信息,为基因工程的关键载体。限制性内切酶识别与切割利用细菌产生的限制性内切酶,可特异性地识别和切割DNA序列,为后续克隆操作提供片段。DNA片段连接通过DNA连接酶,将目的基因片段与载体DNA连接,形成重组DNA分子,完成克隆构建。实验材料与试剂分子生物学试剂包括高保真DNA聚合酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶等核酸操作常用试剂。工具耗材培养皿、移液器、离心管、凝胶成像系统等实验设备和耗材。基因克隆载体pUC、pET、pGEX等常用的质粒载体以及感受态菌株。分子生物检测试剂盒DNA提取、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳等关键实验步骤的配套试剂盒。实验步骤一：DNA片段扩增1目标基因扩增使用特异性引物对目标基因DNA片段进行扩增2引物设计根据目标基因序列设计合适的引物3PCR反应进行PCR扩增反应以获得所需的DNA片段在分子克隆实验中,第一步是对目标基因DNA片段进行扩增。这需要根据目标基因序列设计合适的引物,然后进行PCR反应以获得足量的目标DNA片段。这为后续的克隆和表达创造了基础。基因扩增技术：PCR聚合酶链式反应(PCR)PCR是一种快速、高效的DNA片段扩增技术,能从少量DNA模板中扩增出大量目标DNA片段。温度循环反应PCR反应包括DNA模板的变性、引物结合和DNA合成等温度循环步骤,通过重复循环可以指数级扩增目标DNA片段。特异性扩增通过设计特异引物,PCR能精准地扩增目标DNA片段,避免非特异性扩增。PCR反应成分及参数1模板DNA提供目标基因序列，是PCR反应的起点。需要根据实验目的选择合适的模板DNA。2引物设计特异性引物以标记目标基因的起始和终止位点，确保只扩增特定的DNA片段。3缓冲液维持合适的pH值和离子浓度,确保酶活性和DNA复制效率。4dNTPs提供DNA合成所需的4种脱氧核苷酸,确保新链段的正确生成。PCR产物检测电泳检测通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,可以观察扩增结果并估计DNA片段大小。荧光检测使用特殊的荧光染料,可以在紫外光下观察PCR产物的荧光信号,定性分析扩增效果。测序验证对PCR产物进行DNA测序,可以准确鉴定DNA序列,确保扩增目标基因正确。实验步骤二：DNA片段连接1准备连接反应成分需准备目的基因片段和载体DNA,以及T4DNA连接酶等。2进行连接反应将基因片段和载体DNA混合,加入连接酶和缓冲液,37°C孵育数小时。3连接产物转化将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞,经筛选得到阳性克隆。连接反应原理DNA片段连接DNA片段连接过程利用DNA连接酶将DNA片段的两端连接起来,形成一条完整的重组DNA分子。黏性末端连接DNA片段的酶切位点留有突出的黏性末端,这些末端可以互补配对并被连接酶结合。平末端连接无突出末端的DNA片段,需要通过连接酶将其两端连接起来,形成一条重组DNA分子。连接反应成分及参数连接反应成分连接反应的主要组分包括载体DNA、目的片段DNA、T4DNA连接酶和连接缓冲液等。这些组分需要根据具体实验要求进行配制和调节。连接反应参数连接反应的主要参数包括反应温度、反应时间和DNA浓度比例。这些参数需要根据实验目的和连接效率进行优化。连接产物转化1接受菌培养培养可感受态的受体菌细胞。2DNA转移将连接产物与受体菌细胞混合。3筛选阳性克隆在选择性培养基上筛选转化成功的菌落。将连接产物转化入感受态菌细胞是实现克隆的关键一步。受体菌细胞需要预先培养至可感受态状态,然后与连接产物混合进行DNA导入。成功转化的菌细胞将在选择性培养基上生长,从而被筛选出来进行后续鉴定。阳性克隆筛选涂布转化细菌将连接反应产物转化到感受态细菌中,并将其涂布到含有抗生素的培养基上。挑选可疑菌落培养24-48小时后,观察培养基上生长的可疑菌落,并挑选进行后续分析。提取阳性质粒从阳性菌落中提取质粒DNA,以用于后续鉴定和分析。实验步骤三：重组子鉴定阳性克隆筛选经过DNA连接反应后，将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中进行阳性克隆筛选。酶切鉴定选取几个阳性克隆,提取质粒DNA,并用特异性限制性内切酶对质粒进行酶切,鉴定重组子。DNA测序对重组子进行DNA测序,确保