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酚氯仿法提取DNA主要步骤和原理

酚氯仿法提取DNA是一种常用的分子生物学技术。

一、主要步骤

样品准备：

对于动物组织，通常需要先将其放在离心管中，用酒精和纯水进行梯度脱酒精处理，然后研磨并加入DNA裂解液。

对于其他类型的样品（如植物组织、细菌、病毒等），则需要根据其特性进行适当的预处理。

加入蛋白酶K和裂解液：

将研磨好的组织液加入离心管中，并加入适量的蛋白酶K和DNA裂解液。

蛋白酶K能够水解蛋白质，使其与DNA分离。

裂解液则有助于破坏细胞膜和核膜，释放DNA。

加入酚氯仿混合物：

向离心管中加入等体积的酚氯仿混合物（通常酚:氯仿:异戊醇的比例为25:24:1）。

酚和氯仿都是有机溶剂，它们能够破坏细胞膜和核膜，并沉淀蛋白质。

异戊醇则有助于减少抽提过程中的泡沫产生，并有助于分相。

离心与分层：

将离心管置于离心机中，以适当的转速（如12000R或16000×g）离心数分钟（如5~7分钟）。

离心后，混合物将分成三层：上层为DNA所在的水相，中层为蛋白质层，下层为有机溶剂层。

吸取上层水相：

小心吸取上层水相，并将其转移至新的离心管中。

确保在吸取过程中不携带任何有机相或蛋白质层。

沉淀DNA：

向水相中加入适量的盐（如醋酸钠）和冷乙醇（通常是2倍体积的预冷无水乙醇或-20℃冷冻的100%酒精）。

盐能够中和DNA分子上的负电荷，使其易于沉淀。

乙醇则能够夺去DNA周围的水分子，使其失水而易于聚合。

离心与洗涤：

将离心管置于离心机中，以适当的转速离心数分钟。

离心后，弃去上清液，留下白色沉淀（DNA）。

用70%的乙醇洗涤DNA沉淀，以去除盐分和其他溶剂残留。

溶解DNA：

将洗涤后的DNA沉淀置于室温下挥发至干。

加入适量的蒸馏水或生理盐水溶解DNA沉淀。

二、原理

酚氯仿法提取DNA的原理主要基于以下几点：

有机溶剂的作用：

酚和氯仿作为有机溶剂，能够破坏细胞膜和核膜，使DNA释放到溶液中。

同时，它们还能够沉淀蛋白质，从而实现DNA与蛋白质的分离。

蛋白质变性：

酚能够使蛋白质变性，并抑制DNase的降解作用。

变性后的蛋白质与DNA的联结键断裂，蛋白分子溶于酚相，而DNA则溶于水相。

DNA的溶解性：

DNA分子具有水溶性，因此在酚氯仿抽提过程中会进入水溶液层。

通过加入盐和乙醇等试剂，可以进一步沉淀和纯化DNA。

分相与离心：

异戊醇的加入有助于减少抽提过程中的泡沫产生，并有助于分相。

通过离心作用，可以将混合物分成三层，从而方便地分离出DNA所在的水相。

酚氯仿法提取DNA是一种简单而有效的分子生物学技术，其原理基于有机溶剂对细胞膜和核膜的破坏作用、蛋白质的变性作用、DNA的溶解性以及分相与离心等步骤。