细菌鉴定的一般步骤.pptVIP

细菌鉴定的一般步骤李荣南京农业大学资环院办公室：综合楼B419邮箱：在鉴定菌株之前首先确保菌株的纯度。假若菌株没有纯化好，将会做大量的无用功二、PCR扩增16SrRNA片段菌落直接PCR菌体新鲜、加菌量少、阴性菌较阳性菌容易、退火温度要高点01DNA扩PCR高盐法或CTAB法提取细菌总DNADNA量不要加太多02三、16SrRNA片段测序PCR产物直接测序条带特异，注意产物的浓度要足够，不要纯化01PCR产物克隆测序挑单菌落，菌液测序或质粒测序。02四、系统发育树的构建首先将所获得的16SrRNA片段序列在NCBI数据库中进行序列的比对（序列提交GenBank获得登录号）01从相关数据库下载相关模式种16SrRNA片段序列02采用MEGA软件邻近法做树031Genbank（nationalinstitutesofhealth）、2RDP。3EMBL（Europeanmolecularbiologylaboratory）、4DDBJ（DNAdatabankofJapan）现在比较通用的核酸序列数据库有：核酸序列数据库五、发育树的构建及作用确认目标菌株跟模式菌株间的遗传距离确认目标菌株的分类定位同源性较低，认定可能为新种或新属，有必要重新扩增序列克隆测序010203六、序列同源性差异分析慎重考虑16SrRNA序列同源性在大于97%有做新种的意义16SrRNA序列同源性在97%以下有可能是新属16SrRNA序列同源性在95%以下新属的判定依据16SrRNA序列同源性在95%以下01拥有该科的共有特性02与相邻属的脂肪酸组成及含量有显著差异03生理生化差异明显04极性脂成分有差异05注意：判定依据要根据实际情况而定06七、几个发育树例子的分析DNA杂交(实际情况而定)生理生化特性的分析等分类在一个支上，同源性大于99%，初步判定为地衣芽孢杆菌确定菌株种属213首先确定菌株属的定位（与同属模式菌株数据的比较）查阅文献到IJSEM杂志阅读邻近种属的分类文章菌落形态菌株wd的LB平板菌落照片菌体照片间的比较菌株wd扫描电镜照片Lmetal.IJSEM(2006),56,2409–2414IJSEM(2004),54,385–388IJSEM(2004),54,651–657