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泉州市平菇木霉病菌的分离及鉴定

一、实验材料与方法

(1)实验材料主要包括平菇样品、无菌PDA培养基、无菌水、无菌生理盐水、无菌滤纸、无菌镊子、无菌刀片、显微镜、荧光显微镜、PCR仪、凝胶成像系统、DNA提取试剂盒、DNA扩增试剂盒、特异性引物等。平菇样品来源于福建省泉州市不同地区的市场及农户，共采集了100份样品，其中平菇样品80份，香菇样品20份。无菌PDA培养基用于培养平菇木霉病菌，其主要成分为葡萄糖20g、蛋白胨10g、琼脂15g、蒸馏水1000ml。无菌水用于配制试剂、清洗仪器和材料。无菌生理盐水用于洗涤样品。

(2)实验方法主要包括样品前处理、病菌分离、纯化、菌落形态观察、DNA提取、PCR扩增和序列分析等步骤。样品前处理包括样品的初步筛选、无菌水冲洗、无菌滤纸吸干等。病菌分离采用平板划线法，将样品在PDA培养基上划线，置于恒温培养箱中培养48小时，挑选可疑菌落进行纯化。纯化后的菌落进行形态学观察，包括菌落大小、颜色、质地等特征。DNA提取采用试剂盒法，从纯化后的菌落中提取DNA。PCR扩增使用特异性引物对菌落DNA进行扩增，扩增条件为：95℃预变性5分钟，30个循环（每个循环包括95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒），最后72℃延伸10分钟。PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳条件为：80V电压，30分钟。

(3)序列分析采用生物信息学软件对PCR产物进行测序，获得病菌的基因序列。通过BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）进行序列比对，以确定病菌的分类地位。实验过程中，使用荧光显微镜对病菌进行观察，观察其生长动态、菌丝形态等特征。通过实验结果分析，初步判断平菇木霉病菌的感染程度及传播途径。此外，结合田间调查和农户访谈，收集病菌流行病学资料，为后续防控研究提供数据支持。

二、平菇木霉病菌的分离

(1)分离平菇木霉病菌的实验步骤首先是对采集的平菇样品进行表面消毒处理，使用70%乙醇对样品表面进行擦拭，随后用无菌水清洗样品表面残留的消毒剂。之后，将处理过的样品剪成小块，接种于含有1%氯化钠的PDA培养基上，每个样品接种3个平行样。接种后的平板在25℃恒温培养箱中培养48小时，以观察菌落的生长情况。

(2)在培养过程中，仔细观察平板上菌落的生长形态，记录菌落的大小、颜色、边缘形状、表面质地等特征。对于初步识别为平菇木霉病菌的菌落，使用无菌接种针挑取菌丝，进行平板划线分离。划线后继续培养，直至获得单个菌落。每个菌落重复3次分离，以确保分离出的菌株为纯菌株。

(3)获得的纯菌株接种于PDA斜面培养基上，在25℃恒温培养箱中保存。同时，对分离出的菌株进行初步鉴定，包括观察菌落形态、测量菌落直径、进行显微镜观察等。对于具有典型平菇木霉病菌特征的菌株，进行DNA提取，为后续的分子鉴定做准备。整个分离过程需要严格按照无菌操作规程进行，以防止污染和误诊。

三、平菇木霉病菌的鉴定

(1)鉴定平菇木霉病菌首先进行菌落形态学观察，包括记录菌落的大小、颜色、边缘、表面质地和孢子囊的颜色等特征。将纯化后的菌株在PDA培养基上培养，观察菌落生长速度、菌丝生长状态和孢子囊的形成情况。同时，使用显微镜观察菌丝的横切面，测量菌丝直径，观察是否有隔膜和锁状联合等特征。

(2)接下来进行分子生物学鉴定，包括DNA提取和PCR扩增。使用DNA提取试剂盒从纯化菌株中提取DNA，随后设计特异性引物对目标基因进行PCR扩增。扩增产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，电泳条件为80V电压，30分钟。根据扩增结果，判断菌株是否含有目标基因，并与已知木霉属菌株的基因序列进行比对。

(3)最后，结合形态学观察和分子生物学鉴定结果，对平菇木霉病菌进行综合鉴定。通过比较菌株的形态特征、分子生物学特征和已知木霉属菌株的数据库信息，确定菌株的分类地位。此外，对鉴定出的菌株进行致病性试验，观察其对平菇的致病情况，进一步验证菌株的病原性。整个鉴定过程需严格控制实验条件，确保结果的准确性和可靠性。