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液相色谱-串联质谱测定蜂蜜中的氯霉素残留

一、1.试剂与材料

(1)本实验中使用的试剂包括氯霉素标准品（纯度≥98%）、乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、磷酸二氢钾（分析纯）、氨水（分析纯）以及超纯水。氯霉素标准品需在-18℃以下低温保存，以保持其稳定性。乙腈和甲醇均为色谱纯，适用于液相色谱分析，其使用浓度分别为80%和20%。磷酸二氢钾用于配制流动相，浓度为0.1mol/L，氨水用于调节流动相的pH值至6.5。实验过程中，所有试剂均需按照生产商的推荐进行使用。

(2)实验材料包括蜂蜜样品，需采集自不同地区、不同品牌，以保证实验结果的普遍性和可靠性。蜂蜜样品在采集后需立即置于-20℃冰箱中保存，避免样品中的氯霉素降解。实验前，需对蜂蜜样品进行初步的感官鉴定，包括色泽、气味、口感等，以确保样品的质量。此外，实验中还使用了C18反相色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），适用于分离和检测氯霉素残留。

(3)标准溶液的配制是本实验的关键步骤之一。氯霉素标准品需先用乙腈溶解，配制成1000mg/L的标准储备液，并在-20℃冰箱中保存。使用时，根据需要用流动相稀释至不同浓度的标准溶液。实验中，还需配制混合标准工作液，包括氯霉素和其他可能存在的干扰物质，如四环素、土霉素等。混合标准工作液的浓度分别为0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L。这些标准溶液的配制需严格按照实验室规范进行，以确保实验结果的准确性和重现性。

二、2.样品前处理

(1)样品前处理的第一步为蜂蜜样品的均质化。取适量蜂蜜样品，置于均质化器中，加入适量乙腈，高速均质化至完全溶解。均质化过程中需注意控制温度，避免样品温度过高导致氯霉素分解。均质化完成后，将样品转移至离心管中，以4000r/min的转速离心10分钟，取上清液待测。

(2)接下来进行样品的净化步骤。取适量上清液，通过C18固相萃取小柱，使用乙腈-水溶液（体积比1:1）进行洗脱，流速控制在1.0mL/min。洗脱过程中，需注意控制流速，避免过快导致氯霉素损失。洗脱液收集完毕后，在50℃下氮气吹干，残留物用流动相复溶于1mL乙腈中，待液相色谱分析。

(3)最后，对净化后的样品进行稀释。根据样品中氯霉素的浓度，用流动相将样品稀释至适宜的浓度范围内。稀释过程中需注意保持溶液的均匀性，避免因稀释不均导致分析结果偏差。稀释后的样品在液相色谱-串联质谱仪上进行分析，通过比较样品与标准曲线的峰面积，计算样品中氯霉素残留量。

三、3.液相色谱-串联质谱条件

(1)本实验采用的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）系统为Agilent1290InfinityII液相色谱仪与ABSciexTripleTOF5600串联质谱仪。液相色谱部分使用C18反相色谱柱（4.6mm×100mm，2.1μm），柱温设定为30℃。流动相采用乙腈和0.1mol/L磷酸二氢钾溶液，比例为80:20（V/V），流速为0.3mL/min。梯度洗脱程序为：0-2分钟，乙腈比例从20%升至50%；2-4分钟，乙腈比例维持在50%；4-5分钟，乙腈比例从50%降至20%；5-7分钟，乙腈比例维持在20%。柱温设置为30℃，流速为0.3mL/min。

(2)在串联质谱部分，采用电喷雾离子源（ESI）正离子模式进行检测。氯霉素的检测离子为m/z312.1（分子离子）和m/z314.1（去氢氯霉素），扫描范围为m/z100-1000。碰撞能量（CE）设置为35eV，以实现最佳的离子碎片化效果。在质谱扫描过程中，采用多反应监测（MRM）模式，以m/z312.1→m/z299.1和m/z314.1→m/z291.1作为氯霉素的两个主要特征离子对，以提高检测灵敏度和选择性。在MRM模式下，氯霉素的定量离子对为m/z312.1→m/z299.1，其定量离子丰度比设置为0.9。

(3)实验过程中，通过优化离子源温度（IS）、碰撞池温度（CP）和扫描速度等参数，以获得最佳的检测效果。具体参数如下：离子源温度（IS）为550℃，碰撞池温度（CP）为200℃，扫描速度为3000amu/s。在优化过程中，曾对多个参数进行过调整，如将离子源温度从500℃提升至550℃，以增强氯霉素的离子化效率；将碰撞池温度从180℃提升至200℃，以获得更好的碎片化效果。通过这些优化措施，氯霉素的检测灵敏度得到显著提高，最低检测限（LOD）达到0.1ng/g，定量限（LOQ）达到0.3ng/g。在实际样品分析中，该方法已成功应用于蜂蜜中氯霉素残留的检测，检测结果与国标方法相比，具有良好的一致性。

四、4.氯霉素残留量的测定与结果处理

(1)氯霉素残留量的测定首先通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对样品进行检测。在实验中，将处理