《虾蟹类饲料中β-蜕皮甾酮的测定 高效液相色谱法（征求意见稿）》.docx

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虾蟹类饲料中β-蜕皮甾酮的测定高效液相色谱法

1范围

本文件规定了虾蟹类饲料（包括单一饲料、配合饲料和预混合饲料）中β-蜕皮甾酮的高效液相色谱测定方法。

本文件适用于虾蟹类饲料（包括单一饲料、配合饲料和预混合饲料）中β-蜕皮甾酮的测定。本文件适用于检测浓度范围为0.200mg/L~10.0mg/L，对于超出检测浓度范围内的样品，可进行适当稀释进行检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T683化学试剂甲醇

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T16631高效液相色谱法通则GB/T20195动物饲料试样的制备

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

试样中β-蜕皮甾酮，经40%甲醇溶液提取后，反相C18液相色谱柱分离，紫外-可见光检测器检测，外标法定量。

5试剂与材料

5.1甲醇：优级纯。

5.2水：GB/T6682规定的一级水。

5.3β-蜕皮甾酮标准品（CAS：5289-74-7）：≥99%。

5.4标准溶液配制

5.4.1β-蜕皮甾酮标准储备液（200mg/L）：准确称取10.00mg（精确至0.1mg）β-蜕皮甾酮标准品，用40%甲醇溶解，并定容至50.0mL容量瓶中，摇匀，于4℃下避光保存，有效期6个月。

5.4.2β-蜕皮甾酮标准系列工作液：用移液管分别准确吸取标准储备液（200mg/L）适量，用40%甲醇稀释，配制成浓度分别为10.0mg/L，5.00mg/L，2.00mg/L，0.500mg/L和0.200mg/L的标准工作溶液。

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6仪器与设备

6.1高效液相色谱仪：配紫外检测器。

6.2分析天平：感量0.1mg。

6.3超声波发生器（功率≥1800W)。

7分析步骤

7.1试样制备

按照GB/T20195制备试样，至少200g，粉碎使其通过0.60mm孔径的分析筛，充分混匀，装入密闭容器中，备用。

7.2样品前处理

称取试样约1.0g（精确至0.1mg）于50mL具塞离心管内，以40%甲醇为提取剂，加入30mL40%甲醇超声提取20min，4000r/min离心5min，上清液转移至50mL容量瓶，残渣再加入15mL的40%甲醇，重复超声提取一次，合并上清液并定容至50mL，用0.45μm微膜过滤，上机测试。

注：根据供试品溶液中β-蜕皮甾酮的浓度高低，可进行适当的稀释，确保上机浓度在标准溶液的线性范围内。

7.3空白试验

除不加试样外，按7.2与试样同时处理。

7.4仪器参考条件

a)色谱柱：C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)或具同等性能的色谱柱。

b)流动相A：一级水；

流动相B：甲醇。梯度洗脱，见表1。

表1梯度程序

时间/min

0

11

15

15.1

18

流动相A/%

70

5

5

70

70

流动相B/%

30

95

95

30

30

c)流速：1.0mL/min。

d)波长：246nm。

e)柱温：35℃。

f)进样体积：10μL。

7.5试样溶液的测定

将试样溶液注入高效液相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到试样中β-蜕皮甾酮的浓度。

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8分析结果的表述

试样中β-蜕皮甾酮的含量按照公式（1）计算。

X=×k……..(1)

式中：

X——试样中被测组分的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

ρ——试样溶液中被测组分的质量浓度，单位为毫克每升(mg/L)；V——提取溶液的体积，单位为毫升(mL)；

m——试样质量，单位为克（g）；k——稀释倍数。

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。

9精密度

在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

10检出限和定量限

当取样量为1.0g，定容体积为50mL时，β-蜕皮甾酮检出限为2.0mg/kg，定量限为10.0mg/kg。

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附录A

β-蜕皮甾酮液相色谱图