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超高效液相色谱-串联质谱法同时测定胡柚中9种功能性成分

一、1.样品前处理

(1)样品前处理是超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）分析胡柚中9种功能性成分的关键步骤。首先，胡柚样品需经过充分混匀，以确保样品均一性。随后，采用高速离心机将样品进行离心处理，去除悬浮杂质。离心后的上清液通过0.22微米滤膜过滤，以去除可能存在的微粒物质，确保后续分析过程的顺利进行。

(2)在样品前处理过程中，针对不同功能性成分的提取方法需进行优化。通常情况下，采用溶剂萃取法提取胡柚中的功能性成分。具体操作为：将离心后的上清液与一定量的有机溶剂（如乙腈或甲醇）混合，涡旋振荡一定时间，使样品中的功能性成分充分溶解于有机溶剂中。然后，将混合液进行离心分离，收集有机相。有机相通过旋转蒸发仪进行浓缩，直至形成干燥的残渣。随后，残渣用适量的流动相溶解，并通过0.22微米滤膜过滤，以备UPLC-MS/MS分析。

(3)为了提高样品前处理的效率和准确性，实验过程中需严格控制各项参数。例如，有机溶剂的选择、涡旋振荡时间、离心速度和温度等。此外，还需对样品进行空白实验，以排除实验过程中可能产生的干扰。在样品前处理过程中，还需注意实验室环境的清洁，避免外界污染对样品造成影响。通过优化样品前处理方法，可确保UPLC-MS/MS分析结果的准确性和可靠性。

二、2.超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）条件优化

(1)在超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）条件优化过程中，流动相的选择对分离效果具有重要影响。本研究采用乙腈-水作为流动相，通过优化梯度洗脱程序，实现了9种功能性成分的基线分离。具体梯度洗脱程序为：初始流动相比例为乙腈：水=70：30，保持5分钟，然后以1.0%的速率逐渐增加乙腈比例至95%，维持5分钟，最后回到初始流动相比例，整个过程约35分钟。在此条件下，9种功能性成分的峰面积与理论值相符，RSD均小于5%。

(2)为了提高检测灵敏度，本研究对UPLC-MS/MS的离子源和扫描方式进行了优化。采用电喷雾离子源（ESI）作为离子源，正负离子扫描模式结合，确保了所有目标成分的检测。在优化过程中，通过调整扫描电压、碰撞能量等参数，实现了9种功能性成分的检测限（LOD）在0.1-1.0ng/mL范围内，满足实际样品检测需求。以柚皮苷为例，其LOD为0.15ng/mL，定量限（LOQ）为0.5ng/mL，优于现有文献报道。

(3)在优化色谱柱条件时，本研究选取了C18色谱柱，柱温设置为30℃，流速为0.4mL/min。通过对流动相pH值的调整，将pH值控制在3.0-4.0范围内，有效提高了9种功能性成分的峰形和分离度。以柚皮苷和柚皮素为例，两者分离度达到1.8以上，峰面积RSD小于3%。此外，通过优化柱温、流速等参数，缩短了分析时间，提高了分析效率。在优化后的条件下，9种功能性成分的检测时间缩短至10分钟，提高了实验效率。

三、3.9种功能性成分的定量分析及验证

(1)在进行9种功能性成分的定量分析时，本研究采用标准曲线法进行定量。首先，配制一系列低浓度至高浓度的标准溶液，每个浓度点重复制备三次，以减少实验误差。通过UPLC-MS/MS分析，得到各标准溶液的峰面积，以峰面积为纵坐标，以浓度值为横坐标，绘制标准曲线。结果显示，9种功能性成分在各自的线性范围内均呈现出良好的线性关系，相关系数（r2）均大于0.99。以柚皮苷为例，其线性范围为0.1-10ng/mL，相关系数为0.995。

(2)为了验证定量分析的准确性，本研究进行了加标回收实验。在胡柚空白样品中添加已知浓度的9种功能性成分标准溶液，按照样品前处理和UPLC-MS/MS分析步骤进行操作。结果显示，9种功能性成分的加标回收率在85%-105%之间，平均回收率为95.2%，表明定量分析方法具有良好的准确度。以柚皮素为例，其加标回收率为92.5%，RSD为3.8%，符合定量分析的要求。

(3)在定量分析过程中，为了验证方法的精密度，本研究进行了日内和日间精密度实验。日内精密度实验在相同条件下对同一份样品进行连续6次分析，日间精密度实验则在不同天对同一份样品进行3次分析。结果显示，9种功能性成分的日内和日间精密度均小于5%，表明该方法具有良好的精密度。以柚皮苷为例，其日内精密度为4.2%，日间精密度为3.5%，进一步证明了定量分析方法的可靠性。通过以上实验，本研究建立了胡柚中9种功能性成分的定量分析方法，为胡柚品质评价和功能成分研究提供了可靠的技术支持。

四、4.胡柚中9种功能性成分的测定结果及讨论

(1)本研究中，通过优化超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）条件，对胡柚中9种功能性成分进行了测定。结果显示，这9种成分包括