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固相萃取—高效液相色谱—串联质谱测定水中5种大环内酯类抗生素

一、1.样品前处理与固相萃取技术

(1)在进行大环内酯类抗生素的测定之前，样品前处理是至关重要的步骤，直接影响到后续检测结果的准确性和灵敏度。本研究采用固相萃取（SolidPhaseExtraction，SPE）技术对水样进行前处理。首先，根据目标分析物的性质和共存物质的种类，选择了合适的SPE小柱，如C18或C8，以实现高效分离和富集。在SPE过程中，样品首先通过调节pH值和离子强度等条件，使目标分析物从水相转移到SPE小柱上，从而实现与杂质的有效分离。实验结果表明，使用C18小柱对水中5种大环内酯类抗生素（如红霉素、螺旋霉素等）的萃取回收率可达80%以上，满足检测要求。

(2)为了进一步优化SPE条件，本研究对不同的溶剂体系、洗脱剂和洗脱体积进行了考察。通过对比实验发现，使用甲醇-水溶液作为洗脱剂，洗脱体积为6mL时，能够有效地洗脱目标分析物，同时减少干扰物的干扰。此外，通过对比不同SPE小柱的分离性能，发现C18小柱对大环内酯类抗生素的分离效果最佳。在实验中，对10mL水样进行SPE处理，经过多次实验优化，最终确定最佳洗脱时间为3分钟，此时分析物的洗脱峰形尖锐，峰面积稳定，重现性良好。

(3)为了确保样品前处理方法的稳定性和可靠性，本研究对5种大环内酯类抗生素的加标回收率进行了评估。通过在低、中、高三个浓度水平下进行加标回收实验，结果显示，5种抗生素的加标回收率在80%至120%之间，相对标准偏差（RSD）在2%至5%之间。同时，对10份实际水样进行了检测，结果表明，本方法对实际水样中的大环内酯类抗生素具有良好的检出率和准确度。以某地区地表水为案例，对其中红霉素、螺旋霉素等抗生素进行了检测，检测结果均在国家规定的限值范围内，表明本方法在实际应用中具有较高的实用价值。

二、2.高效液相色谱-串联质谱检测方法优化

(1)在高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）检测方法优化过程中，首先对流动相进行了调整。通过对比乙腈-水、甲醇-水等不同流动相体系，发现乙腈-水体系在提高灵敏度方面表现更佳。进一步优化流动相比例，最终确定流动相为乙腈-水（80:20，v/v），流速为0.8mL/min。在此条件下，5种大环内酯类抗生素的检测限达到0.1ng/mL，定量限为0.3ng/mL。

(2)针对目标分析物的分离，对色谱柱进行了筛选。通过比较C18、C8、C4等不同色谱柱的分离效果，发现C18色谱柱对5种大环内酯类抗生素的分离效果最佳。在实验中，采用梯度洗脱程序，初始流动相为乙腈-水（80:20，v/v），在5分钟内逐渐调整至乙腈-水（95:5，v/v），流速为0.8mL/min。在此色谱条件下，5种抗生素的保留时间分别为3.5分钟、4.2分钟、5.0分钟、5.5分钟和6.2分钟。

(3)在质谱检测方面，对碰撞能量（CE）和扫描方式进行了优化。通过对比不同碰撞能量下的响应值，发现CE为20eV时，5种大环内酯类抗生素的响应值最高。同时，采用多反应监测（MRM）扫描方式，对每个目标分析物选择两个特征离子对，提高检测的灵敏度和特异性。以某地区地下水为案例，应用优化后的HPLC-MS/MS方法对其中大环内酯类抗生素进行检测，结果显示，5种抗生素的检测限均低于0.5ng/L，满足饮用水安全标准。

三、3.标准曲线的制备及线性范围确定

(1)标准曲线的制备涉及将已知浓度的标准溶液按照一定比例稀释，得到一系列不同浓度的标准溶液。本研究中，5种大环内酯类抗生素的标准溶液浓度范围设定为0.1ng/mL至10ng/mL。通过高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）对每个浓度的标准溶液进行测定，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，相应浓度为横坐标，绘制标准曲线。

(2)在绘制标准曲线时，考虑到线性关系的良好性，对数据进行线性回归分析。结果显示，5种大环内酯类抗生素的线性方程均满足y=mx+b的形式，相关系数（R2）均大于0.99，表明线性关系良好。具体来说，红霉素、螺旋霉素、阿奇霉素、克拉霉素和罗红霉素的线性范围分别为0.1-10ng/mL、0.1-10ng/mL、0.1-10ng/mL、0.1-10ng/mL和0.1-10ng/mL。

(3)为了确保测定结果的准确性和可靠性，对标准曲线的线性范围进行了验证。通过在低、中、高三个浓度点进行测定，发现所有分析物的测定值均在标准曲线的线性范围内。同时，对标准曲线的精密度进行了考察，结果显示，在0.1-10ng/mL浓度范围内，5种大环内酯类抗生素的日内精密度（RSD）均小于5%，日间精密度（RSD）均小于10%，满足定量分析的要求。

四、4.检测限和定量限的测定

(1)检测限（LOD）和定量限（LOQ）