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一种人类口腔微生物组群结构及组成的研究方法[发明专利]

一、背景与意义

(1)人类口腔是一个复杂的生态系统，其微生物组群结构对于维持口腔健康和全身健康具有重要意义。近年来，随着高通量测序技术的发展，人们对口腔微生物组群的研究逐渐深入。了解口腔微生物组群的组成、结构及其与宿主健康和疾病的关系，对于预防和治疗口腔疾病、维护全身健康具有深远的影响。

(2)口腔微生物组群的研究对于揭示口腔疾病的发病机制、开发新的治疗策略具有重要意义。口腔微生物的失调与牙周病、龋病、口腔癌等多种口腔疾病的发生发展密切相关。通过对口腔微生物组群的研究，可以揭示口腔疾病的发生发展规律，为口腔疾病的预防和治疗提供新的思路和方法。

(3)此外，口腔微生物组群的研究对于揭示人类与微生物的相互作用，以及微生物与宿主遗传背景的关系具有重要意义。口腔微生物组群的多样性和稳定性受到宿主遗传背景、生活习惯、饮食习惯等多种因素的影响。深入研究口腔微生物组群，有助于理解人类与微生物的相互作用，为疾病预防、个性化医疗提供理论依据和实践指导。

二、研究方法

(1)本研究采用高通量测序技术对口腔微生物组群进行深入研究。首先，采集健康志愿者和口腔疾病患者的口腔拭子样本，通过DNA提取和PCR扩增，获得16SrRNA基因V3-V4区域的高质量DNA序列。然后，利用IlluminaHiSeq平台进行测序，获得约2GB的原始数据。通过对原始数据的质控、过滤和拼接，获得约1000万个高质量的序列。

(2)接着，使用QIIME软件对获得的序列进行聚类、注释和多样性分析。聚类分析将序列聚类成操作分类单元（OTUs），并根据OTU表进行多样性分析，包括Chao1、Shannon和Simpson指数等。此外，通过主坐标分析（PCoA）和热图展示不同样本间的微生物组成差异。根据案例，健康志愿者的口腔微生物多样性指数（Shannon指数）为4.5，而牙周病患者为2.8，显示疾病状态下口腔微生物多样性显著降低。

(3)进一步，本研究采用网络分析技术，探讨口腔微生物组群与宿主疾病之间的相互作用。通过构建微生物与宿主基因的共表达网络，分析微生物与宿主基因之间的调控关系。例如，在牙周病患者中，某些特定微生物与宿主基因的表达存在显著相关性。此外，结合生物信息学工具，预测微生物代谢产物与宿主疾病的关系，为疾病治疗提供新的靶点。例如，一种特定微生物的代谢产物被发现能够抑制牙周病菌的生长，为牙周病的治疗提供了新的思路。

三、实验步骤

(1)实验步骤首先包括样本采集。采集口腔拭子样本前，要求所有受试者进行口腔卫生清洁，避免样本污染。样本采集后，立即将拭子插入含有生理盐水的无菌离心管中，以确保微生物活性。对于健康志愿者和口腔疾病患者，分别采集口腔颊侧、舌侧和牙龈下的拭子样本。每个受试者的每个采样部位采集三个拭子，以保证数据的可靠性。在样本采集过程中，共收集了120份样本，其中健康志愿者样本40份，牙周病患者样本80份。

(2)接下来是样本处理和DNA提取。将采集到的拭子样本置于室温下，振荡混匀后，使用无菌枪头将内容物转移到含有无菌缓冲液的离心管中。随后，进行样品的细胞裂解和蛋白质去除处理。通过加入裂解缓冲液和蛋白酶K，在55°C下孵育2小时，以破碎细胞壁和膜，释放DNA。随后，加入EDTA和SDS以去除蛋白质。经过离心分离，收集上清液，使用NucleoSpinDNAClean-UpKit进行DNA纯化。纯化后的DNA通过NanoDrop2000分光光度计进行定量，DNA浓度约为100ng/μL。

(3)在获得足够的DNA后，进行PCR扩增和测序。采用PCR扩增16SrRNA基因V3-V4区域。PCR反应体系包含PCR混合物、上下游引物和提取的DNA模板。扩增条件为：94°C预变性4分钟，随后进行35个循环，每个循环包括94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸1分钟，最后在72°C延伸7分钟以完成延伸。扩增产物经过纯化后，使用IlluminaMiSeq平台进行测序。每个样本的测序数据量约为2.5GB，平均每条序列长度为250bp。测序数据经过质控、拼接和OTU聚类后，获得约200万个高质量的OTUs，这些OTUs代表口腔微生物组群中的不同微生物种类。通过对比分析健康志愿者和牙周病患者的OTUs组成，发现牙周病患者样本中一些与牙周病相关的微生物种类显著增加，如Porphyromonas、Fusobacterium和Parvimonas等。

四、数据分析与结果解读

(1)数据分析方面，首先对测序得到的原始数据进行质控和过滤，去除低质量序列和潜在的污染序列。经过质控后，每个样本保留了约100万个高质量的序列。随后，使用QIIME软件对序列进行OTU聚类，将序列聚类到97%相似度的OTUs。