胶原蛋白凝胶-眼刺激性试验.docx

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附件3

胶原蛋白凝胶-眼刺激性试验（征求意见稿）

CollagenHydrogel-EyeIrritationTest

范围

本方法规定了化妆品用化学原料胶原蛋白凝胶-眼刺激性试验的基本原则、要求和方法。

本方法适用于化妆品用化学原料的眼刺激性/腐蚀性检测。

试验目的

预测和评价化妆品用化学原料对眼睛是否具有刺激性/腐蚀性。

定义

眼睛刺激性eyeirritation

眼球表面接触受试物后所产生的可逆性炎性变化。

眼睛腐蚀性eyecorrosion

眼球表面接触受试物后引起的不可逆性组织损伤。

跨膜电阻transepithelialelectricalresistance，TEER

跨细胞层的电阻，表征细胞层的完整性，单位Ω·cm2。

试验原理

将人角膜上皮细胞接种在胶原蛋白凝胶上构建人角膜上皮模型，通过检测暴露于受试物后人角膜上皮模型的跨膜电阻随时间的变化来判断角膜上皮屏障的破坏程度，进而预测和评价受试物的眼刺激性/腐蚀性检测。

试验材料与试剂

细胞株

采用人角膜上皮细胞HCE-T，该细胞为贴壁生长。要求来源清晰，代数明确（＜25代）。

培养基

采用DMEM-F12（1：1）混合配养基，加入5%胎牛血清、5μg/mL人重组胰岛素、10ng/mL人重组表皮生长因子、0.5%DMSO、100UI/mL青霉素和100μg/mL链霉素。

受试物的配制

受试物溶液或悬浮液由培养基配制，浓度为2.5%（w/v）。优先选择手动混匀。若受试物不能溶解，则依次选择下述方法促进溶解：

a.涡旋，时间不超过1min；

b.超声，时间不超过2min；

c.加热，最高温度不超过70℃。

当受试物通过以上方法仍不能溶解或形成均匀悬浮液，则应涡旋混匀后立即使用。受试物应在使用前新鲜配制，否则必须证实储存不影响其稳定性。

对照溶液的配制

阳性对照溶液：称取250mg苯扎氯铵，溶解于10mL培养基中，可以超声加速溶解，现用现配。

参考品对照溶液：称取250mg乙醇，溶解于10mL培养基中，现用现配。

阴性对照溶液：称取250mg生理盐水（0.9%氯化钠溶液），溶解于10mL培养基中，现用现配。

试验步骤

角膜上皮模型的制备

胶原蛋白凝胶膜的准备

从4℃冰箱取出嵌入性胶原蛋白干凝胶膜小室，放入12孔板中，恢复至室温，向小室的外侧和内侧分别加入1.5mL和0.5mL培养基，平衡10min，即得到胶原蛋白凝胶膜。

角膜上皮模型的构建

将小室外侧的培养基更换为1.5mL新鲜培养基，吸走小室内侧的培养基，向小室内加入0.5mL密度为1.2×105个细胞/mL的细胞悬液（即6×104个细胞/小室），培养2d后，更换小室外侧的培养基，吸走小室内侧的培养基，气-液界面培养4d~6d，隔天更换小室外侧培养基。

角膜上皮模型跨膜电阻的测定

气-液界面培养第6d时，测定角膜上皮模型的跨膜电阻（TEER）。更换小室外侧的培养基为1.5mL新鲜培养基，向小室内侧加入0.5mL新鲜培养基，保持培养基的温度为28±2℃，将电阻计的长和短电极分别插入小室的外和内侧，测定角膜上皮模型的TEER，TEER值介于140Ω·cm2~220Ω·cm2之间时方可使用。TEER的计算见公式1。

TEER（Ω·cm2）=R（Ω）×面积（cm2） 公式1

其中，R（Ω）为测量的电阻值，面积为角膜上皮模型的面积。

样品测定

分组

2.5%（w/v）的受试物用于试验。应设定空白对照、阴性对照、参考品对照和阳性对照。未种细胞的胶原蛋白凝胶为空白对照。生理盐水、乙醇和苯扎氯铵分别为阴性、参考品和阳性对照。每组3个重复。

受试物的暴露和TEER测定

更换小室外侧的培养基为1.5mL新鲜培养基，向小室内侧加入0.5mL待测液，记录3min内模型TEER值的变化，每10s记录一次，试验温度为28±2℃。

计算

以暴露时间（s）为横坐标，以扣除空白对照的TEER值在初始值中百分比（%）为纵坐标，作图（图1）。根据图1计算延迟时间（s）、强度（%/s）和坪值（%），计算公式见公式2~公式4。

暴露时间（

暴露时间（s）

t1

t2

t3

P3

P2

P1

100

TEER（%）

图1受试物暴露角膜上皮模型后TEER值变化示意图

延迟时间（s）=t1 公式2

强度（%/s）=-（P2-P1）/（t2-t1） 公式3

坪值（%）=100-P2 公式4

其中，t1表示跨膜电阻维持-0.03%/s＜dP/dT≤0的最长时间；t2表示dP/dT≤-0.03%/s后，跨膜电阻再次变为dP/dT＞-0.03%/s的起始时间；t3表示t2+30s；P1、P2和P3分别表示t1、t2和t3时对