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转基因成分PCR定性检测技术PCR反应体系（不包含模板DNA）试剂终浓度单样品体积10样品体积ddH2O14.375μl143.75μl10×PCR缓冲液1×2.5μl25μl25mmol/LMgCl22.5mmol/L2.5μl25μldNTPs0.2mmol/L2μl20μl10μmol/LPrimer10.5μmol/L1.25μl12.5μl10μmol/LPrimer20.5μmol/L1.25μl12.5μl5U/μlTaq酶0.025U/μl0.125μl1.25μl总体积24μl240μl注：PCR缓冲液中有Mg2+的，不应再加MgCl2。转基因成分PCR定性检测技术分装：根据需扩增的样品数量取0.2ml离心管，分别编号，将配制好的反应混合物分装在0.2ml离心管中，每管24μl；然后在每管中加入DNA模板，盖上盖子，弹去气泡，短暂离心使液体置于离心管底部。加入DNA模板。在上面的分装液中加入1μl25ng/μlDNA模板。轻轻振荡并轻微离心，再加约50μL石蜡油（有热盖设备的PCR仪可不加）。PCR反应程序离心10s后，将PCR管插入PCR仪中。反应程序为：95℃变性5min；进行35次循环扩增反应（94℃变性1min，56℃退火30s，72℃延伸30s。根据不同型号的PCR仪，可将PCR反应的退火和延伸时间适当延长）；72℃延伸7min；4℃保存。（SPS、35S、NOS、Bt均使用相同的反应程序。）反应结束后取出PCR反应管，加入约3μl的加样缓冲液，混匀备用。转基因成分PCR定性检测技术转基因成分PCR定性检测技术转基因成分PCR定性检测技术电泳及分析1、琼脂糖凝胶电泳2、结果分析3、异常情况分析转基因成分PCR定性检测技术琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法。琼脂糖：根据琼脂糖溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖。低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等。转基因成分PCR定性检测技术2）凝胶浓度选择：琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～32.00.1～2琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围转基因成分PCR定性检测技术常用三种缓冲液Tris-硼酸（TBE）Tris-乙酸（TAE）Tris-磷酸（TPE）单击此处添加小标题TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀单击此处添加小标题TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解单击此处添加小标题3）电泳缓冲液增加样品的密度保证DNA均匀加入到点样孔中；使样品着色，以简化点样过程；在样品中加入染料，能使其在电场中以可预见的速率移动。转基因成分PCR定性检测技术上样缓冲液有以下3个作用：上样缓冲液（Loadingbuffer）：一般由水、蔗糖和染料(例如：二甲苯胺、溴酚蓝、溴甲酚绿等)组成。DNA样品首先要与上样缓冲液混合，才能加入凝胶中电泳。DNA样品的最大上样量根据片段的数量而定。在0.5cm宽的条带中，能被凝胶成像仪检测到的溴化乙锭染色的DNA，最小量约为的2ng。如果含有超过500ng的DNA，导致拖尾。转基因成分PCR定性检测技术5）琼脂糖电泳的染色剂最常用的染色剂：溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。极强的诱变剂/致癌物质，有慢性毒性。在操作时必须戴手套。GoldView一种可代替溴化乙锭（EB）的新型DNA染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外灯下双链DNA呈现绿色荧光，而单链DNA呈红色荧光。较为安全。种子转基因成分PCR定性检测技术1、转基因技术简单介绍2、转基因作物现状3、转基因成分PCR定性检测技术种子转基因成分PCR定性检测技术转基因技术简单介绍植物转基因方法什么是转基因转入什么基因转基因技术简单介绍什么是转基因将不同来源的DNA分子进行重组，克服了天然物种生殖隔