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草酸青霉木质纤维素降解相关酶类的表征与增效机制研究--第1页
草酸青霉木质纤维素降解相关酶类的表征与增效机制研究
木质纤维素生物质的生物降解研究具有重要的生物学和工业应用意义。对木
质纤维素降解酶系进行组成优化和酶学性质改造,对促进木质纤维素生物转化生
产生物燃料和大宗化产品具有重要价值。
草酸青霉(Penicilliumoxalicum)作为一种重要的产纤维素酶工业微生物,
和里氏木霉相比具有酶系组成和比例更加合理、半纤维素酶活力更高的优点。目
前已有的草酸青霉木质纤维素降解酶系在大规模工业化生产生物乙醇中仍然存
在用量大、成本高的问题。
找到能够促进纤维素降解的关键酶组分、降低生产成本是提高木质纤维素生
物转化经济性的关键途径之。本论文的主要研究结果如下:1.草酸青霉木质纤维
素降解酶库的构建及其成员的酶学性质研究通过同源、异源方式表达了12种木
质纤维素降解相关酶,构建成一个小型的草酸青霉木质纤维素降解酶库。
其中纤维素酶有2种,半纤维素酶有8种,此外还有2个辅助酶。测定了部分
酶库成员的比酶活、最适温度、最适pH、温度稳定性以及pH耐受性。
外源添加β-葡萄糖苷酶能够显著提高草酸青霉高产菌株JU-A10-T酶系对
工业废渣木糖渣的糖化能力,从而减少了达到同等水解效率时酶的用量。2.添加
α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43D等半纤维素酶对预处理木质纤维素底物降解的
促进作用添加α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43D和内切-β-1,4-甘露聚糖酶Man5A
可以明显促进草酸青霉酶系降解水热法预处理的玉米芯和木糖渣时的葡萄糖产
量。
进一步探究Abf43D促进纤维素降解的机理发现,用Abf43D预处理能够提高
底物的转化率,推测其能够通过除去底物中木聚糖侧链上的阿拉伯呋喃糖基,从
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而打破糖化中的抗降解屏障,与内切-β-1,4-木聚糖酶Xyn1OA等协同促进半纤
维素的降解,并有利于纤维素酶对纤维素的水解,最终提高了葡萄糖产量。此外
Abf43D的添加能够缓解木聚糖水解液对纤维二糖水解酶活力的抑制作用。
3.添加醛糖酸内酯酶AltA对木质纤维素糖化中β-葡萄糖苷酶活力和葡萄
糖产量的影响D-葡萄糖酸-1,5-内酯对β-葡萄糖苷酶活力有强烈的抑制作用。
添加AltA能缓解D-葡萄糖酸-1,5-内酯对β-葡萄糖苷酶活力的抑制。
向糖化体系中添加AltA,不仅能提高草酸青霉和里氏木霉酶系的β-葡萄糖
苷酶活力,还能促进纤维素的降解。通过HPLC-ESI-Q-TOFMS分析,证实了当AltA
存在时糖化体系内的D-葡萄糖酸-1,5-内酯水平显著降低。
当添加叠氮化钠和金属离子螯合剂EDTA抑制氧化还原酶类活性后,AltA的
增效作用明显减小。4.裂解性多糖单加氧酶-醛糖酸内酯酶-β-葡萄糖苷酶
(LPMO1-AltA-BGL1)协同体系降解木质纤维素研究及其组分配比的优化证实了
LPMO1-AltA-BGL1体系能够协同降解磷酸膨胀纤维素,并可促进商业纤维素酶降
解微晶纤维素和多种预处理的木质纤维素类底物。
糖化体系中存在AltA时,内酯含量下降、β-葡萄糖苷酶活力上升,说明AltA
缓解了可能由LPMO1产生的内酯对BGL1的抑制,从而使协同体系进一步发挥效果。
利用DesignExβert软件设计了混料实验并预测了优化方案,得到LPMO1、AltA
和BGL1的最优配比约是3:8:14。
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