鱼类细胞工程基础.ppt

动物细胞培养*细胞培养是指从动物活体中取出小块组织分离出细胞，在模拟机体内的生理环境条件下，进行培养，使之继续生存、生长、增殖。1原代培养2传代培养3永久细胞系4细胞培养在水产业的应用*01鱼类病毒学：病毒的分离、鉴定以及病毒疫苗的制备03水产基础理论05鱼类遗传学02鱼类细胞毒理学：评价样品的细胞毒性等04鱼类免疫学本实验课的目的*为将来适应多种领域的工作打基础。掌握无菌操作，养成规范的实验室工作习惯。培养实验的思维，提高实验技能，锻炼动手能力。CBA温度温度过低时细胞生长缓慢甚至不生长。利用冷冻保藏细胞可保持细胞的原有分裂分化能力。温度过高导致细胞死亡。这主要是由酶和蛋白质所需要的最适温度决定的。适宜的温度：25℃(温带鱼)、30℃(热带鱼)、15℃(寒带鱼)、37℃(水生哺乳动物)。鱼类细胞培养的基本条件pH鱼类细胞培养的基本条件*过酸或过碱可导致细胞死亡。这主要与蛋白质的变性和细胞膜的结构受损有关。用NaHCO3和Hepes调节培养液的pH至7.4左右。0102鱼类细胞培养的基本条件*渗透压细胞膜调节渗透压的能力是有限的。需用平衡盐溶液配制各种试剂。常用的平衡盐溶液：PBS：磷酸盐缓冲溶液（phosphatebufferedsolution）D--Hanks鱼类细胞培养的基本条件*营养物细胞培养基：培养基中含有细胞增殖和生长所需要的各种物质。常用培养基：MEM、M199、L-15等动物细胞离体培养常常需要血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。小牛血清；胎牛血清。鱼类细胞培养的基本条件*支持物大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃或塑料培养瓶等作为支持物。气体交换CO2培养箱,调节CO2的比例为5%。去离子水/三次蒸馏水鱼类细胞培养的基本条件*无菌条件体外细胞培养仅仅是对所需的细胞进行培养，但环境中（如空气）有各种其他微生物，必须对所需细胞进行无杂菌的隔离培养。无菌条件是细胞离体培养最基本的条件。超净工作台0102实验室仪器设备*实验室条件：干燥、紫外灯仪器设备：高压灭菌锅:用于高压灭菌干燥箱:用于干燥超净工作台:用于无菌操作玻璃三蒸水器:用于制三蒸馏水恒温生化培养箱:用于恒温培养细胞倒置生物显微镜:用于观察细胞生长液氮罐：用于细胞长期保存考核方法*实验报告（论文格式）目的与意义材料与方法实验结果讨论（问题\经验\体会）要求：多查阅参考文献，实验中胆大心细。修读要求*无菌操作，严格规范操作；01实验是连续性的，需要每天来观察和处理细胞；02每天来做实验的时间与老师和研究生协商，各组时间要相对集中和固定。03实验一二思考题*12543培养基过滤后需要加哪些物质？为什么？为什么胰蛋白酶和培养基要过滤灭菌，不能高压灭菌？生长培养基的pH值应为多少？呈什么颜色？为什么？为什么要培养基中需加入L-谷氨酰胺？为什么复苏细胞时，要迅速解冻？12345实验五染色体制备*每一物种的细胞一般都具有一定数目、形状和大小的染色体。在秋水仙素的作用下可使分裂细胞阻断在中期，此时染色体形态最典型，然后通过低渗、固定、染色等步骤，便可在显微镜下呈现出其形态。准备细胞操作步骤*加2mLPBS混匀细胞培养13-15h培养24h将细胞悬液移到T75cm2的培养瓶内消化细胞，1000rpm离心，5分钟，收集沉淀细胞接种细胞：T75cm2瓶子1个换10mL新鲜medium和0.1mL秋水仙素（1μg/L）鱼类细胞工程基础实验指导老师王敏汤蓉辅助研究生尹晓燕童娜课程安排*实验时间实验内容10月13日实验一培养用液的配制、除菌与分装实验二细胞的复苏（示范实验）10月20日实验三细胞的传代培养10月27日实验四细胞的原代培养（组织块法）11月3日实验五染色体制备实验六细胞的冻存（示范实验）上课时间/地点内容分组（4人一组）2012.10.138:30-10:00/301室水生动物细胞工程基本原理全体10:00-13:00/401室培养用液的配制、除菌与分装；细胞复苏1-4组14:30-17:30/401室培养用液的配制、除菌与分装；细胞复苏5-8组2012.10.208:30-10:00/301室鱼类细胞的传代培养讲解全体