《质粒DNA转化》课件.pptVIP

**************什么是质粒?小型环状DNA质粒是一种独立于细菌染色体之外的遗传物质，以小型环状DNA形式存在于细菌细胞质中。自主复制质粒DNA具有自己的复制起点，能够在细菌细胞内独立复制，并以一定数量存在于每个细菌细胞中。基因表达功能质粒DNA上可以携带某些特定的基因，这些基因能够表达相应的蛋白质，赋予细菌一些特殊的性状。质粒DNA的结构质粒DNA通常为环状双链DNA分子，并具有复制起点、抗生素抗性基因和多克隆位点。复制起点是质粒DNA复制的起始位点，抗生素抗性基因则赋予细菌对特定抗生素的抗性，而多克隆位点是用于插入外源基因的区域。质粒DNA在细胞内的作用作为载体质粒DNA可作为基因工程载体，携带外源基因进入受体细胞，实现基因的克隆、表达和改造。促进复制质粒DNA具有自己的复制起点，可以独立于宿主染色体进行复制，并在细胞内大量积累，便于研究和应用。质粒DNA转化的步骤1感受态细胞准备将细菌细胞处理成能够高效摄取外源DNA的状态2质粒DNA与细胞混合将准备好的质粒DNA与感受态细胞混合3热休克处理利用温度变化促进质粒DNA进入细胞4培养和筛选在含有抗生素的培养基上培养，筛选出成功转化的细胞质粒DNA转化是一个重要的分子生物学技术，它允许将外源DNA导入细菌细胞，以便进行基因克隆、表达和研究感受态细胞的形成1化学方法使用氯化钙等化学物质处理细菌2电穿孔法利用电脉冲使细胞膜暂时性通透3脂质体法将质粒DNA包裹在脂质体中进入细胞感受态细胞是指能够高效摄取外源DNA的细胞。通过特定方法处理细菌，使细胞壁和细胞膜变得更易穿透。常用的感受态细胞制备方法包括化学方法、电穿孔法和脂质体法。热休克处理的原理细胞膜通透性改变热休克处理会暂时改变细菌细胞膜的通透性，使质粒DNA更容易进入细胞内。DNA与受体结合热休克可以促进质粒DNA与细菌细胞膜上的受体蛋白结合，增加转化的效率。细胞修复机制热休克处理会导致细胞的损伤，细胞会启动修复机制，帮助质粒DNA整合到细菌的基因组中。热休克处理的步骤1准备阶段将含有质粒DNA和感受态细胞的混合物放入冰水中，并保持一定时间，使质粒DNA与细胞膜充分结合。2热休克阶段将混合物转移到42℃水浴中，并保持一定时间，促进质粒DNA进入细胞内。3恢复阶段将混合物再次放入冰水中，并保持一定时间，使细胞恢复正常状态，并开始表达新的基因。质粒DNA与受体细胞结合电穿孔强电场作用于受体细胞，形成瞬时孔道，质粒DNA得以进入细胞内。化学转化利用化学物质如氯化钙处理受体细胞，改变细胞膜的通透性，使质粒DNA更容易进入。脂质体介导将质粒DNA包埋在脂质体中，脂质体与细胞膜融合，将质粒DNA送入细胞。质粒DNA进入细胞内电穿孔电穿孔使用高压电脉冲在细胞膜上形成暂时性孔隙，使质粒DNA能够进入细胞内。这种方法通常用于细菌和酵母细胞。化学转化化学转化利用化学试剂，如氯化钙，使细胞膜变得更具渗透性，使质粒DNA能够进入细胞内。这种方法是细菌转化中最常用的方法。脂质体介导脂质体是一种包裹着质粒DNA的脂质囊泡。它们可以与细胞膜融合，将质粒DNA送入细胞内。这种方法通常用于真核细胞，如哺乳动物细胞。显微注射显微注射是一种直接将质粒DNA注射到细胞核中的方法。这种方法通常用于体外细胞培养，并可以实现高转化效率。质粒DNA复制和表达质粒DNA进入宿主细胞后，会利用宿主细胞的复制机制进行复制。质粒DNA复制开始于复制起点，并根据其复制方式分为两种：1滚环复制单个起点，单向复制2θ型复制双向复制，形成θ形结构3表达质粒DNA上的基因被转录和翻译质粒DNA上的基因可以被宿主细胞的转录和翻译系统识别和利用，产生相应的蛋白质。菌落篮查的原理11.基因表达筛选通过观察细菌菌落颜色或生长特征判断目的基因是否表达成功。22.抗生素抗性筛选质粒中带有抗生素抗性基因，转化后的细菌可以在含有对应抗生素的培养基上生长。33.酶活性筛选通过检测目标蛋白的酶活性来确认目的基因的表达和功能。44.荧光标记筛选利用荧光蛋白标记的目的基因，通过观察细菌的荧光信号来确认转化成功。菌落篮查的步骤1铺板将转化后的细菌均匀涂布在培养皿上。2培养将培养皿放入培养箱中，在适宜的温度下培养。3筛选根据抗生素抗性等特征筛选出含有重组质粒的菌落。菌落篮查是质粒DNA转化后筛选重组菌的关键步骤。重组质粒的选择抗生素抗性基因筛选重组质粒最常用的方法是抗生素抗性基因筛选。报告基因报告基因可以方便地检测质粒在宿主细胞中的表达，例如荧光