质粒分子生物学与质粒技术.ppt

质粒分子生物学与质粒技术第1讲质粒分子生物学概论什么是质粒质粒的复制分配和不相容性质粒的接合转移细菌质粒控制的表型①抗性质粒②毒力质粒③降解质粒④共生质粒什么是质粒1.1定义和命名质粒是染色体以外能自主复制的遗传因子，不具有胞外期，对寄主细胞来说是非必需的，符合这三条标准的染色体外DNA或RNA分子都可以称为质粒。狭义的质粒一般是指细菌染色体外的环状DNA分子。质粒的命名：一个小写字母p加2-3个大写字母和数字，如pJP4，pDTG1。细菌质粒细菌细胞中染色体以外的共价闭合环状DNA分子(cccDNA)，其大小在1-1700kb之间。根据质粒控制的性状，可以把细菌质粒分成抗性质粒、降解质粒、毒力质粒和共生质粒等类型。真核生物的DNA质粒1环状DNA质粒：酵母2mm质粒，植物线立体中的环状DNA质粒，人和动物的核DNA质粒等，它们都是不知其功能的隐蔽质粒。线状DNA质粒：乳酸克鲁维酵母的嗜杀线状DNA质粒，植物线粒体中与雄性不育有关的线状DNA质粒。2真核生物的RNA质粒有壳体的dsRNA质粒：由蛋白质壳体包裹，存在于某些真菌和植物细胞中，由于它们酷似病毒，所以也常被称作真菌病毒和植物隐蔽病毒，或称类病毒颗粒，典型代表是酿酒酵母的嗜杀dsRNA质粒。与RNA病毒的主要区别是它们不具有感染性．无壳体的dsRNA质粒：存在于脂质小囊中的栗疫菌减毒dsRNA质粒，玉米线粒体中与雄性不育有关的dsRNA质粒。质粒的复制、分配和不相容性2.1复制(Replication)质粒的复制起始和拷贝数是由质粒DNA序列控制的。质粒分子中为质粒复制所必需的最小区段称为基本复制子，它由两部分组成，一是复制原点(ori)，二是调节复制起始的基因（编码蛋白质或RNA)。2.3不相容性(Incompatibility)两种质粒不能在同—个寄主细胞中共存的现象，叫质粒的不相容性。质粒之间的不相容性，是由于它们存在—种或几种与质粒复制或分配有关的相同因子，如基本复制子中的反向转录区(ColE1质粒的RNAⅠ)，ori区中的重复子(Iteron)，与分配蛋白结合的分配位点。不相容性是质粒分类的理想标准。肠道细菌质粒分别属于30多个不相容组，用Inc表示。质粒的接合转移通过细胞与细胞之间的接触，使DNA从一个细胞转移到另外一个细胞的现象叫接合(Conjugation)。这一过程由接合性质粒的转移(tra)基因区编码。被转移的DNA可以是接合质粒本身，也可以是染色体或可诱动的非接合性质粒。得到供体DNA的受体细胞称为接合体或接合子。每个供体细胞所产生的接合体数称为接合频率。3.1F质粒的接合转移机制F质粒的分子大小为100kb，编码接合转移功能的tra基因区位于遗传和物理图谱的66.6－100kb位置，编码37个蛋白质和1个反义RNA，这些分子分别负责性菌毛的合成和装配，杂交对的稳定，表面排斥，DNA转移，以及tra区基因表达的调节。12543图1-10F质粒接合转移区的结构（66.6-100kb区）traA：性菌毛亚基； traN和traG：杂交对稳定；traS和traT：表面排斥； traM：转移信号；traY：缺口酶； traI：DNA解旋酶；traD：驱动单链DNA转移；traJ、finO、finP：调节基因123453.2细菌染色体的诱动细菌的染色体与质粒的转移原点oriT序列共价连接，染色体作为质粒DNA的延伸部分被转移。可以利用这一功能定位染色体基因，以及获得含有染色体片段的质粒。3.3非接合质粒的诱动许多天然质粒虽然是非接合性的，但仍然含有一个oriT位点和转移基因，当与它共存的接合质粒提供一个接合系统时，也能进行有效的转移，称之为诱动(Mobilization)。细菌质粒控制的表型4.1抗性质粒包括抗菌素抗性（R）质粒和金属抗性质粒。R质粒的进化、转移和扩散给抗菌素治疗带来很大麻烦，是医学所面临的重大问题之一。R质粒与转座子（Transposon）和整合子（Integron）的相互作用，使细菌耐药性问题更加严重。4.2毒力质粒许多细菌的致病力和毒性与质粒有关，如大肠杆菌肠毒素和定居抗原，破伤风毒素，炭疽毒素，溶血毒素，苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白，植物冠瘿病（Ti质粒）和发根病（Ri质粒）。pTi-SAKURA的分子结构（206479bp，195ORF）毒力基因（22）：virA,virB1B2B3B4B5B6B7B8B