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黄曲霉毒素测定法操作规程

一、样品准备

(1)样品准备是黄曲霉毒素测定法中的关键步骤，直接影响测定结果的准确性。首先，应对样品进行彻底的混匀，以确保样品均匀性。例如，对于粮食样品，可以使用四分法将样品分为四份，然后取其中两份进行进一步处理。对于液体样品，应充分摇匀后取样。在取样过程中，应确保使用无菌容器，以避免污染。根据《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量》（GB2761-2017），粮食样品的取样量通常为500g，而液体样品的取样量根据样品体积而定。

(2)样品前处理是样品准备的重要环节。对于含有黄曲霉毒素的样品，通常需要进行提取和净化。提取过程中，可以选择合适的溶剂，如乙腈、甲醇等，以提取样品中的黄曲霉毒素。提取后的样品需要通过液-液分配、固相萃取等净化步骤，以去除干扰物质，提高检测灵敏度。例如，使用固相萃取柱对样品进行净化，可以有效地去除样品中的脂溶性杂质，提高检测的准确性。在实际操作中，应根据样品类型和预期目标毒素浓度选择合适的净化方法。

(3)样品前处理完成后，需进行适当稀释，以确保测定结果在仪器检测范围内。稀释倍数通常根据样品中目标毒素的预期浓度和仪器的检测限来确定。例如，如果样品中黄曲霉毒素B1的浓度预计为50ng/g，而仪器的检测限为1ng/g，则需要进行100倍的稀释。在实际操作中，应记录所有样品的稀释倍数，以便后续准确计算样品中目标毒素的浓度。此外，还应进行空白实验，以排除样品前处理过程中可能引入的污染。

二、仪器与试剂

(1)仪器方面，黄曲霉毒素测定法通常需要高效液相色谱仪（HPLC）或液相色谱-质谱联用仪（LC-MS/MS）。HPLC用于分离样品中的黄曲霉毒素，而LC-MS/MS则用于检测和定量。HPLC系统应配备紫外检测器（UV）或荧光检测器（FLD），以检测黄曲霉毒素。LC-MS/MS系统则需配备适当的电离源，如电喷雾电离（ESI）或大气压化学电离（APCI），以及高灵敏度检测器，如三重四极杆质谱仪。此外，样品处理过程中可能需要使用超声波清洗器、涡旋混合器等辅助设备。

(2)试剂方面，黄曲霉毒素测定法中常用的试剂包括乙腈、甲醇、磷酸盐缓冲溶液、三氟乙酸等。乙腈和甲醇常用于样品的提取和清洗，而磷酸盐缓冲溶液则用于配制流动相。三氟乙酸可用作流动相的酸化剂，以提高分离效果。此外，还需准备黄曲霉毒素标准品，用于建立标准曲线和校准仪器。标准品应购买正规厂商的产品，并确保其纯度和稳定性。在实验过程中，所有试剂均需使用分析纯级别，以避免对测定结果的影响。

(3)为了确保实验结果的准确性和可靠性，所有仪器和试剂均需定期进行校准和维护。对于HPLC和LC-MS/MS等精密仪器，应按照制造商的推荐进行校准，包括流动相的pH值、流速、柱温等参数。对于试剂，应检查其有效期和储存条件，确保其质量符合实验要求。此外，实验室应制定详细的仪器和试剂使用规范，对操作人员进行培训，以保证实验操作的规范性和一致性。

三、测定步骤

(1)测定步骤首先包括样品的提取。以粮食样品为例，通常采用乙腈-水溶液作为提取溶剂，以提取样品中的黄曲霉毒素。具体操作为：将500g粮食样品用乙腈-水溶液（体积比1:1）浸泡过夜，然后采用超声波提取30分钟。提取液经离心后，取上清液进行净化。在此过程中，根据样品中黄曲霉毒素的预期浓度，可能需要将提取液稀释至适当浓度。例如，如果样品中黄曲霉毒素B1的浓度预计为50ng/g，则提取液可能需要稀释100倍。

(2)净化步骤是确保测定结果准确的关键。采用固相萃取（SPE）法进行净化，使用C18小柱对提取液进行净化。具体操作为：将提取液通过SPE小柱，用适量水洗涤小柱，然后用甲醇洗脱目标毒素。洗脱液在氮气下浓缩至近干，用流动相复溶于适当体积的溶液中。例如，若使用LC-MS/MS进行检测，流动相通常为乙腈-0.1%甲酸溶液，pH值为3.0。在此过程中，为确保黄曲霉毒素的回收率，需进行空白实验，以排除净化过程中可能引入的污染。

(3)检测和定量步骤采用LC-MS/MS进行。首先，将净化后的样品进行适当稀释，以确保测定结果在仪器检测范围内。例如，若样品中黄曲霉毒素B1的浓度预计为50ng/g，则需将样品稀释至5ng/mL。随后，将样品注入LC-MS/MS系统，进行分离和检测。在LC-MS/MS分析中，黄曲霉毒素B1的保留时间为9.5分钟，其母离子为278.2m/z，子离子为230.1m/z。通过建立标准曲线，将样品中目标毒素的峰面积与标准曲线进行比对，即可计算出样品中黄曲霉毒素B1的浓度。例如，若某样品中黄曲霉毒素B1的峰面积为10000，标准曲线的斜率为10000，截距为5000，则样品中黄曲霉毒素B1的浓度为(10000-5000)/10000=0.5ng/mL，即样品中黄曲霉毒素B1的浓度为