细胞融合及应用.ppt

基于酶缺陷型细胞和药物抗性所建立的杂种筛选基于营养缺陷型细胞所建立的杂种筛选由温度敏感型细胞组成的杂种细胞的筛选具有所需性状杂种细胞的筛选常用的杂种细胞筛选方法第四节细胞融合技术应用举例动物细胞融合—单克隆抗体生产利用原生质体融合和培养技术培育新植物微生物原生质体融合构成新菌株一、何谓单克隆抗体？应用1：细胞杂交瘤技术与单克隆抗体只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。T淋巴细胞：即胸腺依赖淋巴细胞（thymusdependentlymphocyte）。亦可简称T细胞。来源于骨髓的多能干细胞（胚胎期则来源于卵黄囊和肝）。目前认为，在人体胚胎期和初生期，骨髓中的一部分多能干细胞或前T细胞迁移到胸腺内，在胸腺激素的诱导下分化成熟，成为具有免疫活性的T细胞。成熟的T细胞经血流分布至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，并可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环，发挥细胞免疫及免疫调节等功能。T细胞的再循环有利于广泛接触进入体内的抗原物质，加强免疫应答，较长期保持免疫记忆。T细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原和表面受体。这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。人类免疫系统的介绍外分泌淋巴系统：呼吸道和生殖泌尿系统内分泌淋巴系统：胸腺、骨髓、脾脏、扁桃体、淋巴结等B淋巴细胞：来源于骨髓的多能干细胞。在禽类是在法氏囊内发育生成，故又称囊依赖淋巴细胞（bursadependentlymphocyte）/骨髓依赖性淋巴细胞简称B细胞，是由骨髓中的造血干细胞分化发育而来。与T淋巴细胞相比，它的体积略大。这种淋巴细胞受抗原刺激后，会增殖分化出大量浆细胞。浆细胞可合成和分泌抗体并在血液中循环。成熟的B细胞经外周血迁出，进入脾脏、淋巴结，主要分布于脾小结、脾索及淋巴小结、淋巴索及消化道粘膜下的淋巴小结中，受抗原刺激后，分化增殖为浆细胞，合成抗体，发挥体液免疫的功能。B细胞在骨髓和集合淋巴结中的数量较T细胞多，在血液和淋巴结中的数量比T细胞少，在胸导管中则更少，仅少数参加再循环。B细胞的细胞膜上有许多不同的标志，主要是表面抗原及表面受体。这些表面标志都是结合在细胞膜上的巨蛋白分子。B1细胞为T细胞非依赖性细胞。B2为T细胞依赖性细胞。B细胞在体内存活的时间较短，仅数天至数周，但其记忆细胞在体内可长期存在。B细胞淋巴瘤是一种最常见的淋巴细胞白血病，有关这种疾病的研究不断涌现。单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞(myelomacell)与经特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到杂交瘤细胞(hybridomacell)，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridomatechnology）。NielsK.JerneKohlerMilstein免疫网络学说单克隆抗体：1984Nobel二、杂交瘤技术的基本原理骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体01选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）02胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）03（一）骨髓瘤细胞选择及选择性培养基三、杂交瘤细胞的制备HAT培养基次黄嘌呤（hypoxanthine，H）氨基喋呤（aminopterin，A）胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine，T）次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）（二）免疫小鼠免疫程序是取6—8周龄Balb／C雌鼠，基础免疫2周，静脉再加强免疫一次，3—5天后用于融合。免疫时是否采用佐剂和事先处理抗原，要依抗原性的强弱而定。一般来讲可溶性抗原用完全佐剂效果较好。抗原量同样与抗原强弱有关，以IgG为例，第一次为l00?g，第二次为50?g，免疫途径第一次可经腹腔注射。对于细胞性抗原不用佐剂，每次腹腔注射1×l06一1×107。引颈处死小鼠，用酒精消毒体表；无菌条件下取出脾脏，剃除结缔组织和脂肪，用5ml无血清培养液冲洗一次；把脾脏置于已消毒的90一100目不锈钢网或尼龙纱网中；在脾中部切开一小口，用注射器芯从一端轻轻压挤，再用无血清培养液冲洗，令细胞通过纱网，收集入平皿中，或用注射器向脾脏内注入3ml无血清培养液，反复抽吸数次方法获取细胞，再制成细胞悬液亦可；把细胞悬液注入50ml离心管中，加l0一20ml培养液：轻轻吹打数次，室温中置5分钟；离心(800一1000转／分)计数、备用。123456（三）脾细胞的制备细胞准备收集骨髓瘤细胞，用无血清培养液洗3次(37℃)，计数活力细胞(不