转基因动物技术.ppt

Knock-outgeneKnock-outstopcassetteKnock-outlabel1来自啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)2其中重组酶FLP可催化位于同一分子上两个同向frt位点间DNA片段的同源重组，实现基因切除的效果。3作为“第二分子开关”FLP/frt系统与Cre/loxP系统一起，更精密的调控基因表达FLP/frt重组系统Cre的表达还可以通过在启动子上引入相应某种配体的元件(比如某种药物)而达到时间控制和组织特异性表达。四环素、1型干扰素、三苯氧胺(Tamoxifen，可以与一种与雌激素受体相互作用的蛋白相结合)都被用于获得药物诱导型的启动子。时间控制和组织特异性表达Si-Bmi-1LSL-Cre:loxp-stop-loxp,CreFSF-Flpo:FRT-stop-FRT,FlpoEstablishedLungTumorsES细胞打靶和筛选HSV-tk：单纯疱疹病毒胸苷激酶，自杀基因HSV－tk基因的产物使细胞能利用培养基中的GANC(Gancyclovir，丙氧鸟苷）而死亡例如将在肝癌细胞中可表达AF基因的调控区与水痘一带状疮疹病毒中的胸苷激酶（VZV-TK）基因进行重组，构建逆转录病毒载体导入体内，TK基因只在肝癌细胞中表达，产生的TK可催化6-甲基嘌呤阿拉伯糖核苷磷酸化产生araAMP，进一步磷酸化形成细胞毒物质araATP，杀死肝癌细胞。卡那霉素抗性基因编码的是新霉素磷酸转移酶II，基因记做neo，能通过降解G418、新霉素和卡那霉素来实现真核和原核细胞的相应抗性。一般应用于原核生物就是卡那霉素抗性基因,应用于真核生物就是G418抗性。Neo基因2电穿孔法3逆转录病毒载体法1外源基因导入ES细胞的方法有:5磷酸钙沉淀法4脂质体包装法*********TransgenicTechnologyDefinitionTransgenictechnologyreferstothegeneticengineeringofanorganismsothatitsgenomicDNAisalteredtoover-orunderexpresscertaingenes.Transgenictechnique01GeneKnockOut02GeneKnockIn03GeneKnockDown04GeneTrapping05mouse,rabbit,rat,sheep,pig,cawetc.06The2007NobelPrizeinphysiologyormedicineisawardedfortheirdiscoveriesofprinciplesforintroducingspecificgenemodificationsinmicebytheuseofembryonicstemcells.OliverSmithiesMartinJ.EvansMarioR.CapecchiEvans’swork:TheEScellsStemcellMartintalksabouthisworkembryonicstemcell，ESsomaticstemcell MarioCapecchiandOliverSmithies,independentlyofeachother,discoveredhowhomologousrecombinationbetweensegmentsofDNAmoleculescanbeusedtotargetgenesinthemammaliangenomeanddevelopedmethodstogenerategeneticallymodifiedmice.01030204构建打靶载体ES细胞打靶和筛选囊胚注射动物杂交筛选转基因小鼠构建过程北京诺兰信科技北京高校生物技术转化平台HealthSciencesDriveStonyBrook,NY11790-3350，USA打靶载体定点突变技术STRATAGENE，AgilentTechnologiesInc分子开关--Cre/Loxp系统Cre：由P1噬菌体编码的约38KD的重组酶，不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的DNA序