细胞化学与组织化.ppt

三、实验材料、试剂和仪器1.材料小白鼠2.试剂1)甲醛钙固定液：甲醛10ml,10%氯化钙10ml,蒸馏水80毫升。2)酸性磷酸酶作用液:称取硝酸铅25mg,加0.05mol/L乙酸缓冲液22.5ml,搅动使之全部溶解后,再缓慢地滴加3%β-甘油磷酸钠液2.5ml,边加边搅动防止产生沉淀,总量25ml.(现配制,不能储存)。3)2％硫化铵溶液：硫酸铵2毫升＋98毫升水。4)0.05mol／L乙酸缓冲液。A液（0.2mol/L乙酸液）：冰醋酸1.2ml加蒸馏水100ml。B液（0.2mol/L乙酸钠液）：NaAc.3H2O2.72g加蒸馏水至１00毫升。取A液３０毫升＋B液70毫升＋蒸馏水300毫升。16%淀粉肉汤:牛肉膏0.3g,蛋白胨1.0g,NaCl0.5g,可溶性淀粉６.0g，蒸馏水１00ml，煮沸灭菌，４℃保存，使用时热水浴融化。2仪器、用具：注射器、恒温水箱、显微镜、擦镜纸、解剖盘、解剖剪、盖玻片、吸水纸。3前处理小白鼠每日腹腔注射６％淀粉肉汤１ml，连续注射３天．在第３－４h,再向腹腔注射１ml生理盐水，过３～５min用颈椎脱臼法处死小鼠，剖开腹腔，吸取腹腔液．030201四、实验方法与步骤２.制片1.将腹腔液滴一滴于冰冻的干净载玻片上，涂开，自然干燥。2.放入作用液中，37℃保温30min。3.蒸馏水漂洗片刻。4.放入甲醛钙固定液中固定5min。5.蒸馏水漂洗片刻。6.放入2%硫化铵液3-5min。7.蒸馏水漂洗,镜检。3.对照实验:标本放入作用液前先用高温（50℃）处理30min,使酶失去活性，做好标记，其它步骤同上3-7步。五、实验中的注意事项作用液中铅离子的浓度是至关重要的，必须现配现用，当铅离子浓度过低时产生的磷酸离子不能被捕捉而引起弥散，并可进入细胞核内造成细胞核染色的假阳性，孵育时间过长也可发生酶扩散和核染色的现象．六、实验结果与分析白细胞的细胞质中，出现许多棕色或棕黑色的颗粒和斑块。部分细胞内，酸性磷酸酶极为丰富,整个细胞质区域都有黑色沉淀。中性粒细胞呈现阴性反应。简图表示所观察到的酸性磷酸酶显示结果和分布。01思考题在制片的过程中为什么要采用冷冻涂片？02七、实验报告及思考题实验三酯酶的显示（Gomori醋酸a-奈酯法）南昌大学生命科学学院范丽华掌握非特异性酯酶的显示方法及实验原理。01观察各类非特异性酶在细胞内的分布。02一、实验目的二、实验原理非特异性酯酶（nonspecificestarases)广泛分布于动、植物组织内，肝、肾和小肠内活性最强．此酶定位于内质网、溶酶体，可能还有线粒体和胞质内．酶活性最适pH为５～８．其在细胞内的作用尚不清楚．非特异性酯酶又根据E600、DFP、PCMB等对它们的抑制作用分为羧酸酯酶（A-酯酶)、芳香酯酶（B-酯酶)、乙酰酯酶(C-酯酶)等．本实验以a-醋酸奈酯为底物，经酶水解产生奈酯，立即与坚牢蓝RR盐耦联，形成黑色偶氮染料．此酶的酶解和耦联反应进行得非常快，需时很短．三、实验材料及试剂鲫鱼试剂配制PBSpH7.4:Na2HPO4.12H2O27.2gNaH2PO4.2H2O3.49g配成一升溶液酯酸a-奈酯0.25g冷丙酮6.25ml坚牢蓝仪器注射器、显微镜、擦镜纸、解剖盘、吸水纸。四、实验方法滴一滴鱼血再涂片，让其自然晾干。在冷丙酮中固定10-15分钟，再在室温下晾干。在作用液中反应10-15分钟。用自来水冲洗2分钟左右。等晾干后在显微镜下观察。对照（1）10-5mol/L二乙基对硝基磷酸盐（E600）或10-4mol/L二异丙氟磷酸(DFP)抑制B-酯酶，不抑制A-酯酶和C-酯酶。（2）10-4mol/L对氯汞甲酸（PCMB）能抑制A-酯酶，却能激活C-酯酶。细胞核染成深兰色，酯酶主要存在细胞质中染为棕黑色。在对照组中(1)中细胞质中染为棕黑色,为A-酯酶和C-酯酶存在部位。在对照组中(2)中细胞质中染为棕黑色处为C-酯酶存在部位。0102五、实验结果与分析简图表示所观察到的酯酶显示结果和分布。01思考题在实验中为什么采用冷丙酮进行固定?02六、实验报告及思考题早退,保持整洁、安静、有序的实验环境。自觉遵守课堂纪律,维持课堂秩序,不迟到、不法，了解所需使用仪器。认真预习实验课内容熟悉实验目的、原理和方齐，仪器、药品摆放整齐、有序，公用试剂用毕,物归原处。地面及水池内不得乱丢废物。实验台面保持