神经细胞体外培养方法及应用.pptVIP

神经细胞体外培养方法及应用田东萍汕大医学院病理教研室神经组织的体外培养方法是由Harrison，于1907年首创的。01由于该方法具有简化细胞生化环境、明确生长条件、便于施加实验因素及容易获得活体直接观测结果等优点，因而已成为研究神经系统结构和功能的有效手段。02九十余年来，这项技术已从组织块（或植块）培养（explantculture）发展到分离细胞培养(dissociatedcellculture)，并逐渐与多种现代技术结合起来，在神经科学各领域发挥了重大作用。03神经细胞体外培养的历史组织块培养→分离细胞培养→甚至单一型细胞培养神经组织的植块培养法悬滴培养方法单盖玻方法双盖玻方法1925改良双盖玻方法培养物：CNS灰质、白质、外周神经节或神经小段↓↓突起非神经元外伸所需培养液量少，可反应组织代谢中微量生化改变保留了植块内组织特征优点1培养空间小，O2CO2供少2培养空间湿度难以控制，水分会蒸发3密封手续繁杂，不利更换培养液，难以观察单个神经元生长。不足1956年，Nakai首创了神经组织的分离培养方法材料来源：胚胎动物神经组织神经元增殖发生于胚胎期形态学分化和化学分化程度低，体外存活强，成熟后则相反，且神经元会受到大的普遍损伤。部位：灰质、PNS神经节，神经元集中，密度大神经元的分离细胞培养方法人工培养基02无血清培养基化学限定性培养基03天然合成成分血清血浆胚胎撮液01常用的：DMEM+添加剂F1204神经元的体外培养液葡萄糖为神经元能量代谢主要来源33mm01CO2NaHCO3缓冲系统重要HEPESO2耗量更高02K+神经元生理活动的重要离子，K+是神经元存活所必需的，K+24.5mM能提高神经元存活，促分化03非神经元成分的抑制有2-3天04神经元无血清限定培养液人工合成的培养基虽然具备了细胞生长的基本营养物质和无机盐类，但仍无法满足不同类型细胞的特殊需要。大多数神经元在基础培养液中即使能够存活也为期不长，更难以分裂。因此可根据神经元的特性，给基础培养中再添加某些特殊物质。定连续细胞系的体外生长条件。试定该细胞系来源的细胞的培养液条件。0102选择添加剂的基本过程Bottenstein实验室经过长期研究发现如下添加剂比较好1人转铁蛋白、牛胰岛素、硒酸钠、孕酮、腐胺加入到F12与DMEM1:1混液中，可以代替血清添加物，用来培养大鼠CNS的成神经细胞瘤细胞。删去其中任何一种添加物都可导致成神经细胞瘤细胞生长状况锐减。该实验室共列出了三种神经元限定性培养添加物的配方，代号分别为N1、N2、N3。2胰岛素5μg/ml转铁蛋白5μg/ml腐胺100Um硒30nM孕酮20nMN1的配方为01胶元02多聚赖氨酸03LN神经体外培养的生长基质孕18~20天大鼠胚胎新生1~3天大鼠脊髓后根节大脑皮质01?与CMF-Hanks液一起移至离心管?舍弃CMF-Hanks液，再加入5ml0.25%胰蛋白酶和5滴0.2%Dnase液?在CMF-Hanks液中取出组织除去脑膜02神经细胞培养操作程序表370C，30min?舍弃胰蛋白酶，加入5ml培养液和10滴Dnase液?用巴斯德吸管吹打20次，再用套有微量加样器头的加样器吹打20次?若有组织残渣，将上清移至新试管再加3ml培养液反复吹打?将细胞悬液收集于离心管，离心1200r/min，8min，舍去上清，向沉淀加培养液，离心1200r/min，8min?加入培养液调整悬液中的细胞浓度，神经节细胞为1×1071?2种入涂有poly-D-lysine的盖片上，每片50μl3?4放入CO2孵箱中过夜5?6次日加3ml培养液7?82天后（培养的第三天）换入有DNA合成阴断剂的培养液9神经元的分离培养过程大鼠大脑皮层神经组织细胞培养组织来源新生大鼠1-2日龄，碘酒，洒精消毒。断头，取出大脑，分离脑膜，夹取两侧大脑皮质放入接种培养液中，用D-Hank’s冲洗二遍。剪碎，0.5-1mm3,用D-Hank’s充分洗去残血加入5-10倍量0.25%胰蛋白酶，移入离心管中放到水370C浴箱中消化20-25分钟。终止消化离心洗涤2000转/分，5分钟弃上清。吹打制成细