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超高效液相色谱法测定酱油中黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2的含量

一、1.样品前处理

(1)样品前处理是超高效液相色谱法测定酱油中黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2含量的关键步骤之一。在处理过程中，首先需要对酱油样品进行适当的稀释，以降低样品的浓度，使其适应超高效液相色谱仪的检测范围。通常，酱油样品的稀释倍数在10-100倍之间，具体稀释倍数根据样品的实际浓度和仪器检测限确定。例如，某酱油样品中黄曲霉毒素B1的初始浓度为50ng/mL，而仪器检测限为5ng/mL，则该样品需稀释20倍。

(2)稀释后的样品需进行净化处理，以去除干扰物质。常用的净化方法包括固相萃取（SPE）和液-液萃取。SPE法操作简便，回收率高，是测定酱油中黄曲霉毒素常用的净化方法。以固相萃取为例，通常使用C18小柱对样品进行净化。具体操作步骤为：将稀释后的样品通过C18小柱，使用甲醇或乙腈等溶剂进行洗脱，收集洗脱液，并在氮气下浓缩至近干。随后，使用流动相复溶于适当体积的溶剂中，以便进行下一步的色谱分析。

(3)净化后的样品在色谱分析前还需进行适当的过滤，以防止颗粒物堵塞色谱柱。常用的过滤方法包括0.22μm有机滤膜过滤和0.45μm水系滤膜过滤。以0.22μm有机滤膜过滤为例，将净化后的样品通过有机滤膜，去除可能存在的颗粒物和杂质。这一步骤对于保证色谱分析的准确性和重复性至关重要。在实际操作中，某酱油样品经过前处理后，黄曲霉毒素B1的回收率在90%以上，表明样品前处理方法稳定可靠。

二、2.超高效液相色谱法原理及仪器条件

(1)超高效液相色谱法（UHPLC）是一种高效、灵敏的分析技术，广泛应用于食品、药品、环境等领域。其原理是基于不同物质在固定相和流动相之间的分配系数差异，实现混合物中各组分的选择性分离。在UHPLC系统中，高压泵将流动相以恒定的流速输送至色谱柱，流动相中的待测物质在色谱柱内与固定相进行相互作用，根据各物质在固定相上的停留时间不同，实现分离。

(2)UHPLC仪器主要由高压泵、色谱柱、检测器和数据处理系统组成。高压泵负责提供稳定的流动相压力，确保样品快速、均匀地通过色谱柱。色谱柱是分离的核心部件，其固定相材质和结构对分离效果有重要影响。常用的固定相有C18、C8、苯基等。检测器包括紫外检测器（UV）、二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器（FLD）等，用于检测和定量分析。数据处理系统用于记录和分析色谱数据。

(3)在UHPLC分析酱油中黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2时，通常采用梯度洗脱程序，以优化分离效果。流动相系统一般采用乙腈-水作为流动相，其中乙腈作为有机相，水作为水相。梯度洗脱过程中，有机相比例逐渐增加，使黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2等极性较强的物质先被洗脱，而极性较弱的物质则在后续阶段被洗脱。检测波长通常选择在365nm，以获得最佳的检测灵敏度。色谱柱温度一般设定在30-40℃，以减少柱内压力波动，提高分离效果。

三、3.黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2的检测方法

(1)黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2的检测方法通常包括样品前处理、色谱分离和检测定量三个步骤。样品前处理过程中，采用固相萃取（SPE）技术，使用C18小柱进行净化，以去除酱油样品中的杂质。例如，某研究采用SPE法对酱油样品进行前处理，黄曲霉毒素B1的回收率在92%-98%之间，表明该方法具有良好的重现性。

(2)色谱分离采用超高效液相色谱法（UHPLC），使用C18色谱柱，流动相为乙腈-水，梯度洗脱程序。检测波长设定为365nm，以实现黄曲霉毒素的高效分离。例如，某实验采用UHPLC法对酱油样品中黄曲霉毒素进行分离，分离时间为8分钟，峰面积积分值与浓度呈线性关系，相关系数R2大于0.99。

(3)检测定量采用荧光检测器（FLD），检测限可达0.5ng/mL。在实际应用中，某地区对酱油产品进行抽检，采用该方法检测出5个样品中黄曲霉毒素B1的含量分别为0.8ng/g、1.2ng/g、0.5ng/g、1.0ng/g和0.9ng/g，均符合国家食品安全标准。此外，该方法对酱油中黄曲霉毒素B2、G1、G2的检测限也在0.3ng/g以下，满足实际检测需求。

四、4.结果计算与分析

(1)在进行黄曲霉毒素B1,B2,G1,G2含量的测定后，结果计算与分析是确保数据准确性和可靠性的关键环节。首先，根据样品的稀释倍数和SPE小柱的回收率，计算出实际样品中黄曲霉毒素的浓度。例如，若样品稀释倍数为50倍，SPE回收率为95%，则实际浓度计算公式为：实际浓度（ng/g）=测得浓度（ng/mL）×稀释倍数×回收率。假设测得浓度为2.5ng/mL，则实际浓度为2.5ng/mL×50×0.95=117.5ng/g。

(2)接下来，对计算出的实际浓度进行