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单克隆免疫亲和柱-高效液相色谱法测定酱油中伏马毒素B1、B2

一、1.样品前处理

(1)样品前处理是单克隆免疫亲和柱-高效液相色谱法测定酱油中伏马毒素B1、B2的重要步骤，其目的是去除干扰物质，提高检测灵敏度和准确性。首先，对酱油样品进行初步过滤，通常使用0.45μm的滤膜以去除悬浮颗粒和杂质。然后，根据样品中伏马毒素B1、B2的浓度，选择合适的稀释比例，以确保后续分析在检测限范围内进行。例如，当样品中伏马毒素B1、B2的浓度较高时，可能需要稀释100倍以上，而低浓度样品则可能只需稀释10倍。

(2)在稀释后的样品中，加入一定量的沉淀剂，如乙腈和盐酸，通过振荡混合使蛋白质和脂类等杂质沉淀。沉淀过程通常在室温下进行，时间约为30分钟。沉淀完成后，以离心机以3000rpm的速度离心10分钟，去除沉淀物。此时，上清液中含有伏马毒素B1、B2，可用于下一步的富集。

(3)富集伏马毒素B1、B2采用单克隆免疫亲和柱，该柱对伏马毒素具有高度的特异性。将处理后的上清液缓慢通过免疫亲和柱，伏马毒素B1、B2被柱上的单克隆抗体捕获。未结合的干扰物质则随洗脱液流出。富集后，使用含0.1%TFA的乙腈进行洗脱，收集洗脱液。为提高伏马毒素的回收率，洗脱过程通常在室温下进行，时间约为10分钟。最后，将收集的洗脱液在氮气下吹干，残留物用流动相复溶于适当体积的溶剂中，以便进行高效液相色谱分析。

案例：在某酱油产品中检测伏马毒素B1、B2时，首先对样品进行稀释，稀释倍数为100倍。加入乙腈和盐酸进行沉淀处理后，上清液通过0.45μm滤膜过滤。富集过程中，使用含0.1%TFA的乙腈洗脱，收集的洗脱液经吹干和复溶于流动相后，进行高效液相色谱分析。结果显示，酱油中伏马毒素B1、B2的浓度为0.5ng/g，符合食品安全标准。

二、2.单克隆免疫亲和柱富集伏马毒素B1、B2

(1)单克隆免疫亲和柱是富集伏马毒素B1、B2的关键设备，其核心是柱上的单克隆抗体，这些抗体能够特异性地结合伏马毒素B1、B2，从而实现从复杂样品中高效富集目标毒素。在操作过程中，首先将处理后的样品溶液通过免疫亲和柱，伏马毒素B1、B2与抗体结合而被截留在柱上。这一步骤通常在室温下进行，流速控制在0.5mL/min左右，以确保充分结合。

(2)结合完成后，使用适当的洗脱液（如含0.1%TFA的乙腈）对免疫亲和柱进行洗脱，洗脱液流过柱子时，未结合的干扰物质被冲洗掉，而伏马毒素B1、B2则被洗脱下来。洗脱过程同样在室温下进行，流速控制在1mL/min，洗脱时间约为10分钟。收集的洗脱液中含有富集的伏马毒素B1、B2，随后进行浓缩处理，以降低溶剂体积，便于后续分析。

(3)浓缩后的样品通常使用旋转蒸发仪在低温下进行浓缩，以减少溶剂蒸发过程中的热分解风险。浓缩完成后，将残留物用流动相复溶于适当体积的溶剂中，以恢复到适宜的检测浓度。这一步骤对于提高检测灵敏度和准确度至关重要。复溶后的样品经过0.22μm滤膜过滤，除去可能存在的微粒，最终用于高效液相色谱分析。在实际操作中，富集效率通常达到90%以上，能够满足食品安全检测的要求。

三、3.高效液相色谱法检测与定量

(1)高效液相色谱法（HPLC）是伏马毒素B1、B2定量的主要分析手段。样品经过单克隆免疫亲和柱富集后，使用高效液相色谱仪进行分离和检测。分析前，将样品溶液注入HPLC系统，通过填充有特定色谱柱的仪器进行分离。色谱柱通常选用C18或C8键合硅胶，以实现伏马毒素B1、B2的高效分离。

(2)分离完成后，伏马毒素B1、B2在检测器中产生信号。常用的检测器包括紫外检测器（UV）和荧光检测器（FLD）。UV检测器对伏马毒素具有较好的响应，而FLD则能够提供更精确的定量结果。通过比较标准曲线上的峰面积，可以计算出样品中伏马毒素B1、B2的浓度。

(3)定量分析过程中，需要建立标准曲线，通常采用一系列已知浓度的伏马毒素B1、B2标准溶液。通过测定这些标准溶液的峰面积，绘制标准曲线，用于样品中伏马毒素的定量。分析完成后，根据样品的峰面积和标准曲线，计算得到样品中伏马毒素B1、B2的最终浓度，确保检测结果的准确性和可靠性。