实验四革兰氏染色技术(精).pptVIP

实验四革兰氏染色技术一、实验目的学习微生物制片、染色的基本技术掌握细菌革兰氏染色及无菌操作技术进一步观察细菌的基本形态1.菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。2.染料：结晶紫液、碘液、95%乙醇、复红液。3.其他：显微镜、载玻片、接种环、酒精灯、无菌生理盐水、香柏油、二甲苯等。二、实验原理1）通透性学说革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，含大量脂质，乙醇易渗入。2）等电点学说革兰阳性菌等电点（pI2~3）比革兰阴性菌（pI4~5）低，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。3）化学学说革兰阳性菌菌体含大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；革兰阴性菌菌体含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色。革兰染色液的配制1.结晶紫染液①结晶紫酒精饱和液：取14g结晶紫溶于100ml95％的酒精内②１%草酸铵水溶液：草酸铵0.8g溶于80ml蒸馏水中。将已配好之①液20ml和②液80ml混合即成，置瓶中备用。2.芦戈氏碘液碘1g；碘化钾2g；蒸馏水300ml先将碘化钾2g溶于100ml蒸馏水中，再加碘1g，用力摇匀待溶解后加蒸馏水至300ml即成。供革兰染色媒染用。3.95％酒精4.石炭酸复红稀释液碱性复红饱和溶液：碱性复红3.2克溶于95%酒精100ml中。5%石炭酸水溶液1份碱性复红饱和液加9份5%石炭酸水溶液，先配成石炭酸复红染液（抗酸染色用），取1份石炭酸复红染液加9份蒸馏水即为稀释复红染液。上述各种染液配成后，均需用滤纸过滤后使用，染液应贮存于棕色瓶内。细菌经碱性染料结晶紫染色，再经碘液媒染，用酒精脱色，细菌紫色不被脱去，称之为革兰氏阳性菌（G+）；细菌紫色可被脱去，称之为革兰氏阴性菌（G-）。为观察方便，脱色后再用一种红色染料，如碱性复红等进行复染。阳性菌仍带紫色阴性菌则被染上红色有芽孢的杆菌和绝大多数球菌，以及所有的放线菌和真菌都成革兰氏阳性反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都成阴性反应。初染：加结晶紫媒染：加碘液脱色：加酒精复染：复红液阳性菌G+阴性菌G－三、实验步骤1．涂片取洁净玻片一张，按以下步骤操作：（1）肉汤培养物涂片：①右手拿接种环的黑色胶柄部分，左手托持试管。②接种环以15°角置于酒精灯的外焰中烧灼灭菌，直至金属丝烧红，然后将金属柄部也回旋通过火焰烧灼灭菌。③用右手小指和手掌小鱼肌侧拔下左手所持混合菌液的试管盖，并立即火焰烧灼试管口灭菌。④用已灭菌冷却的接种环伸入试管中取出菌液。注意勿使沾有菌液的接种环触及试管壁及试管口。⑤再次灭菌试管口，盖好试管，放回原处。⑥将接种环上之菌液涂于载玻片上，制成的菌膜直径约1cm左右。然后将接种环用火焰烧灼灭菌。为防止细菌溅散污染环境，接种环灭菌前，须先将接种环靠近火焰或放内焰中烤干，然后再在外焰中烧红灭菌，杀死残留的细菌。液体标本（如脓液、痰液等）均可照此法涂片。（2）斜面培养物涂片：用细菌斜面（或平板）培养物涂片，需预先将接种环沾取生理盐水1~2环置于载玻片中央，然后再按上述无菌操作法从斜面培养物上沾取葡萄球菌或大肠杆菌菌苔少许，混于生理盐水中，轻轻研匀，涂成直径lcm左右的均匀薄膜。2．干燥涂片最好在室温自然干燥，如需加速干燥，也可将涂面向上，小心地放置离火焰20㎝处，远离火焰上方微加温略烘促使干燥（切勿加热过度，以防将标本烧枯）。3．固定标本干燥后，常用加热固定法。在火焰的最热部分让玻片有菌膜的面向上，通过酒精灯火焰三次（约2~3秒钟），固定之目的是使细菌蛋白变性，菌体牢固黏附于玻片上，还可杀死细菌，改变菌体对染料的通透性。4．染色1.初染：于涂抹面上滴加结晶紫染液1～2滴，覆盖涂面，室温染色一分钟。用细流水冲洗剩留染液，甩去片上积水。2.媒染：滴加卢戈碘液，室温作用一分钟，细流水冲洗，甩去积水。3.脱色：将载玻片浸于95%酒精缸中，上下提取，边提边看，直至涂面流下的液体无色为止（约30秒钟）。细流水冲洗，甩去积水。4.复染：加稀释石炭酸复红染液1～2滴，染色30秒钟，细流水冲洗，吸水纸吸干玻片水分。5.油镜检查5.结果染色片待干后，于油镜下，调强光视野观察，呈紫色的为革兰阳性菌，呈红色的为革兰阴性菌。葡萄球菌染成紫色，为革兰阳性，以G+表示；大肠杆菌染成红色，为革兰阴性，以G-表示。菌悬液涂片干燥滴加无菌水固定取菌苔涂片四、注意