重组DNA技术与基因工程.ppt

酵母启动子的可控性温度控制型启动子pho4TS-PHO5启动子：酿酒酵母PHO5启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打开；PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子；因此，装在pho4TS-PHO5启动子下游的外源基因在35℃时关闭，23℃诱导表达。PHO4温度敏感型突变基因pho4TS的编码产物在35℃时失活；酵母启动子的可控性温度控制型启动子a型启动子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa型启动子受体细胞基因组重组质粒a型启动子hmla2-102MATaa1Sir3-8TSa型启动子a2a125℃35℃a-a型启动子：酿酒酵母有a和a两种单倍体，分别由MATa和MATa两个等位基因决定。a1因子决定a细胞特征表达a2因子阻遏a细胞特征表达a1-a2阻遏a细胞特征表达编码a2因子的基因突变型hmla2-102能产生a2变体，它能灭活a1，同时阻遏a型酵母启动子的可控性超诱导型启动子GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达GAL1GAL7GAL10UASGAL4GAL80半乳糖诱导时，GAL4高效表达，GAL1、GAL1、GAL10超高效表达GAL10Promoter酿酒酵母的半乳糖利用酶系由GAL1GAL7和GAL10基因编码GAPDH、磷酸甘油激酶PKG、乙醇脱氢酶ADH）中96%酵母菌对密码子的偏爱性外源基因稳态mRNA的浓度以上的氨基酸是由25个密码子编码的。在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛-3-磷酸脱氢酶外源基因在酵母中表达的限制因素外源基因mRNA的翻译活性酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的甘油1醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH、磷酸甘油激酶基因PKG、乙醇脱氢2酿酒酵母表达系统3酶基因ADH所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达。4酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往使得5有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能6大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。7酵母表达系统的选择乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒pKD1已被广泛用作重组异源蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也乳酸克鲁维酵母表达系统能稳定遗传40代以上。于酿酒酵母表达系统。乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能均优酵母表达系统的选择巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生1巴斯德毕赤酵母表达系统2长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达。因此生长3迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯4德毕赤酵母表达系统的三大优势。5由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因6的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上。在此情况下，外源基因7具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。8的高效表达在一定程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20余种9酵母表达系统的选择酵母表达系统的选择巴斯德毕赤酵母表达系统得成功表达。目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，HARS质粒多型汉逊酵母表达系统个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。能高频自发地整合在受体的染色体DNA上，甚至可以连续整合100多克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列HARS已被酵母表达系统的选择利用重组酵母生产乙肝疫苗由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重的传染病，每年约有200万病人死亡，并有3亿人成为HBV携带者，其中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其广泛应用提供了可靠的保证。F6外源基因在酵母中的表达产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母乙型肝炎病毒的结构与性质产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母利用重组酵母生产乙肝疫苗F6外源基因在酵母中的表达乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链DNA病毒，具有感染力的病毒1颗粒呈球面状，直径为42nm，基因组仅为3.2kb。病毒颗粒的