《RTPCR技术原理》课件.pptVIP

*******************RTPCR技术原理实时荧光定量PCR（RTPCR）是一种灵敏且精确的分子生物学技术，广泛应用于各种领域，例如医学诊断，生物学研究和食品安全。by什么是RTPCR实时荧光定量PCR是一种基于PCR技术的核酸定量方法，可用于检测和量化目标基因的表达水平，并分析基因表达的变化。实时监测反应过程利用荧光染料或荧光探针实时监测PCR反应过程，实时收集荧光信号数据，并进行定量分析。精确的定量分析可用于进行基因表达差异分析、病原体检测、基因分型、药物敏感性检测等研究领域。RTPCR的工作原理第一步：反转录将RNA模板转录成cDNA，为后续PCR扩增提供模板。第二步：PCR扩增利用热稳定DNA聚合酶，以cDNA为模板进行指数扩增，生成大量目标基因片段。第三步：荧光检测实时监测PCR扩增过程中荧光信号的变化，通过信号强度来判断目标基因的表达量。RTPCR的基本流程1RNA提取从样品中提取总RNA，去除DNA污染，确保RNA完整性。2反转录以RNA为模板，在反转录酶的作用下合成cDNA，用于后续的PCR扩增。3PCR扩增使用特异性引物和Taq酶，对cDNA进行指数扩增，检测目标基因的表达水平。4荧光检测利用荧光染料或探针，实时监测PCR反应过程中的荧光信号，定量分析目标基因的表达量。5数据分析根据荧光信号的变化，绘制标准曲线，进行相对或绝对定量分析，得出目标基因的表达结果。反转录酶的作用催化反转录将RNA模板转变为cDNA。合成互补DNAcDNA序列与RNA模板完全一致。为PCR提供模板cDNA作为PCR反应的模板进行扩增。引物的设计与选择11.特异性引物必须与目标基因序列特异性结合，避免与其他基因序列发生非特异性扩增。22.序列长度引物长度一般为18-25个碱基，过长或过短都会影响扩增效率和特异性。33.碱基组成引物中G+C含量应控制在40%-60%，避免过高或过低，影响退火温度和扩增效率。44.二级结构引物本身不应该形成二级结构，例如发夹结构或自互补结构，以免影响引物与模板的结合。引物特异性的重要性避免假阳性结果特异性引物确保只扩增目标基因，防止其他序列的非特异性扩增，避免错误的阳性结果。确保实验结果的准确性特异性引物是RTPCR实验准确性的基础，确保只检测目标基因的表达，得到可靠的实验数据。提高定量分析的精度特异性引物可以准确地反映目标基因的表达水平，提高定量分析的准确性和可靠性。探针的作用和类型探针的作用探针是RTPCR反应中重要的组成部分，它们能够特异性地结合到靶序列，并发出荧光信号，从而帮助我们检测和定量目标基因的表达。探针的类型TaqMan探针分子信标探针蝎式探针不同的探针类型具有不同的设计原理和检测机制，根据实验需求选择合适的探针类型。探针的设计原则特异性探针序列必须与目标基因序列完全匹配，避免与其他基因序列发生交叉反应，确保检测结果的准确性。稳定性探针需要具有良好的稳定性，能够在PCR反应中保持完整，不受高温、酶等因素的影响。灵敏度探针的灵敏度要足够高，能够在低浓度目标基因的情况下产生明显的荧光信号。长度探针的长度通常在20-30个碱基对之间，过长或过短都会影响其性能。SYBRGreen染料的机理SYBRGreen是一种常用的荧光染料，在实时荧光定量PCR(qPCR)中广泛应用。SYBRGreen能够与双链DNA结合，在激发光照射下发出荧光，荧光强度与结合的DNA量成正比。在qPCR反应过程中，随着PCR扩增产物的增加，结合的SYBRGreen染料也越来越多，导致荧光信号增强。TaqMan探针的工作原理1探针与靶序列结合TaqMan探针与目标DNA序列的特定区域结合25核酸酶活性当DNA聚合酶到达探针位置时，其5核酸酶活性会将探针切割3荧光信号释放探针切割后，荧光报告基团与淬灭基团分离，产生荧光信号TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，带有荧光报告基团和淬灭基团。当探针完整时，淬灭基团抑制报告基团的荧光发射。当PCR反应进行时，探针与目标DNA序列结合。荧光信号的检测与分析1荧光信号收集实时PCR仪检测每个循环的荧光强度。2数据处理软件分析荧光信号变化，绘制标准曲线。3定量分析根据标准曲线计算目标基因的表达量。荧光信号的检测与分析是实时PCR的关键步骤，确保实验结果的准确性和可靠性。标准曲线的绘制1建立标准曲线使用已知浓度的模板进行RT-PCR反应，通过获得的Ct值建立标准曲