新概念疫苗与基因免疫.ppt

(三)接种剂量与周期1.接种剂量小鼠：50~100ug/次。2.接种周期最佳免疫接种次数为3次，最佳间隔接种时间为3周。第93页,共111页，星期六，2024年，5月七、免疫保护效果的评价(一)细胞免疫的评价(二)体液免疫的评价第94页,共111页，星期六，2024年，5月(一)细胞免疫的评价细胞免疫(cell-mediatedimmunity,CMI)主要针对胞内寄生菌、寄生虫、病毒、移植物等。▽CD4+Th1细胞活化产生细胞因子起作用；▽CD8+CTL特异性杀伤靶细胞。第95页,共111页，星期六，2024年，5月1.淋巴细胞增殖功能检测淋巴细胞增殖实验又称为淋巴细胞转化实验，T、B淋巴细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在体外经特异性抗原或非特异性有丝分裂原刺激，会产生一系列增殖的变化，如细胞变大、细胞浆丰富、空泡出现、核仁明显、染色质疏松，淋巴细胞转变成淋巴母细胞。PHA----非特异淋转；特异性抗原----仅使已经相应抗原致敏的T细胞发生转化，通过两者比较，就可以了解核酸疫苗接种后，淋巴细胞被激活的情况。形态计数法、3H-TdR(3H胸腺嘧啶苷)掺入法、MTT(四甲基偶氮唑蓝)法。第96页,共111页，星期六，2024年，5月2.T细胞介导的细胞毒作用DNA疫苗活化(或致敏)的CTL再次遇到带有特异抗原的靶细胞时，可表现出对靶细胞的破坏和溶解作用。该作用是受MHCI类分子限制的，即CTL识别的抗原要靠与MHCI类分子结合，同时必须是自已本身的MHCI类分子。机体内大多数有核细胞都有MHCI分子，都有可能成为本身CTL的靶细胞。从经相应DNA疫苗免疫的小鼠脾脏分离单核细胞作为效应细胞(CTL)，选择来源于同一品系(遗传背景相同)、带有特异抗原的肿瘤细胞系作为靶细胞，来进行细胞毒实验。方法：51Cr释放试验、乳酸脱氢酶释放试验等。第97页,共111页，星期六，2024年，5月3.细胞因子检测Th1型细胞因子：IL-2、IL-12、IFN-r等，促进细胞免疫；Th2型细胞因子：IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等，促进体液免疫等。▽免疫学方法，如ELISA等；▽生物学方法，即细胞因子活性检测；▽分子生物学方法，如分子杂交、RT-PCR等。第98页,共111页，星期六，2024年，5月4.特异性致敏淋巴细胞检测酶联免疫斑点试验(enzyme-linkedimmunospotassay,ELISPOT)第99页,共111页，星期六，2024年，5月ELISPOT第100页,共111页，星期六，2024年，5月(二)体液免疫的评价核酸疫苗诱导抗原特异性B细胞分化为浆细胞，产生特异性抗体，抗体再发挥中和抗原等生物学效应。通过抗体的检测来评价DNA疫苗诱导的体液免疫水平。用已知抗原测特异性抗体：如双向琼脂扩散试验、ELISA法、免疫荧光法、放射免疫法、Westernblot等。第101页,共111页，星期六，2024年，5月八、核酸疫苗的安全性评价质粒DNA整合到真核细胞染色体中1.是否会导致肿瘤的发生？随机插入同源重组逆转录病毒基因插入在体外转染时发生，在体外转化细胞长期表达的基础(例如G418筛选整合细胞)，其发生率为10-4。同源重组的发生率极低(10-7)到目前为止，在组织标本中检测质粒DNA时，还没有发现有基因组整合的证据，尚无因使用DNA制剂而导致基因整合的报道。因此，基因疫苗是安全的。第102页,共111页，星期六，2024年，5月2.长期表达抗原的问题PCR跟踪发现，质粒DNA可在肌肉内持续存在1个月以上。长期表达外源抗原可能产生意外的不良后果，理论上可产生耐受性、自身免疫、超敏反应等。将核酸疫苗接种新生小鼠诱导了耐受性，在成年动物接种DNA疫苗未见诱导免疫耐受状态。但是，如果是弱抗原的基因疫苗接种成年动物，诱导免疫耐受是有可能的，所以尽量选择免疫原性较强的目的基因。第103页,共111页，星期六，2024年，5月3.抗DNA抗体的形成质粒DNA免疫原性非常弱，不会像重组疫苗那样诱发针对载体的自身免疫反应，至少目前没有检测到抗DNA抗体的报道。4.其他问题▽质粒上通常还有抗生素抗性基因，对人体的影响？▽不用抗生素抗性基因，又如何筛选呢？▽如何彻底去除内毒素的污染？▽质粒DNA能否保持环状等？应用前景非常乐观第104页,共111页，星期六，2024年，5月九、常用研究方法举例鼠疫菌重组质粒pcDNATE/F1-V的构建及其免疫效果的研究。免疫学杂志，2005;21(3