兔病毒性出血症2型诊断技术规范.docxVIP

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DB5101/TXXX—2021

兔病毒性出血症2型诊断技术规程

1范围

本文件规定了兔病毒性出血症2型的临床诊断、普通RT-PCR方法及荧光定量RT-PCR方法等诊断技术。

本文件适用于成都市内兔病毒性出血症2型的鉴别与诊断。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

NY/T541兽医诊断样品的采集、保存与运输技术规范

农医发〔2017〕25号病死及病害动物无害化处理技术规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

兔病毒性出血症2型rabbithemorrhagicdiseasetype2

是由兔出血症病毒2型引起的家兔和野兔的一种急性、高度传染性、高致死率的疫病。

4临床诊断

4.1流行特征

各年龄段的家兔和野兔均易感，传播快、死亡率高，死亡率为5%-70%，幼龄兔死亡率可高达100%。

4.2临床症状

潜伏期1-3天。最急性的病例在发病后1-2h内迅速死亡；急性发病兔表现为精神沉郁，食欲不振，体温升高，呼吸困难，部分发病兔伴有神经症状。

4.3病理剖检

病死兔剖检以肺脏出血、充血和脾脏肿大为主要特征，肝、肾等实质器官可见出血等病变

4.4临床诊断结果判定

结合流行病学特征，出现临床症状和病理剖检症状，可初步判定为疑似兔病毒性出血症2型感染。

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5实验室诊断样品采集及处理

实验室诊断样品样品的采集及处理按照NY/T541的规定执行。病死兔按农医发〔2017〕25号的

规定执行。

6RT-PCR方法

6.1试剂

6.1.1RNA提取试剂

6.1.2PCR预混液（2×);反转录试剂

6.1.3无核酸酶水，配置方法见附录A.1

6.1.4TAE缓冲液，配置方法见附录A.2

6.1.51%的琼脂糖凝胶，配置方法见附录A.3

6.1.66×上样缓冲液。

6.2仪器设备

6.2.1自动化核酸提取仪。

6.2.2PCR扩增仪

6.2.3台式低温高速离心机（最大离心力12000g以上）。

6.2.4稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。

6.2.5凝胶成像仪（或紫外投射仪）。

6.2.6微量可调移液器（2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL等不同规格）。

6.2.7无核酸酶离心管与吸头。

6.2.8PCR扩增管。

6.3引物序列

引物针对RHDV2VP60基因的保守区域设计。上游引物RHDV2-F：5’-GTCATTTGTRCCCTTCAGCG-3’；下游引物RHDV2-R：5’-CATCAACACTCAAGCCAAGT-3’。扩增产物大小577bp。

6.4操作步骤

6.4.1RNA提取

采用核酸提取试剂提取各类样本中的病毒RNA。或用自动化核酸提取仪提取各类样本中的病毒RNA。抽取的RNA立即进行后续试验或置于-60℃以下保存。

6.4.2反转录反应

反应体系为10μL，在PCR反应管中依次加入下列反应物：5×AMV反应缓冲液2μL；

反转录引物50μmol/LOligodT0.5μL；AMV反转录酶0.5μL；

随机6核苷酸引物100μmol/L0.5μL；无核酸酶水4.0μL；

RNA模板2.5μL，

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混匀后瞬时离心，随后进入反转录循环37℃15min，65℃5s，产物直接用PCR扩增或暂存于-20℃备用。

6.4.3PCR扩增反应体系

每个样品配置45μLPCR反应混合液，组成如下：

无核酸酶水18μL

PCR预混液（2×)25μL

RHDV2-F（10μmol/L)1μL

RHDV2-R（10μmol/L)1μL

将45μLPCR反应混合液加入每个PCR扩增管；将5μL反转录模板加入PCR扩增管中。每次进行普通RT-PCR扩增时均需设立阳性对照（阳性重组质粒为模板）、阴性对照（无核酸酶水为模板）。加入模板后，密封PCR管，瞬时离心。将所有PCR扩增管放在PCR仪中，按照6.4.4条件运行扩增程序。

6.4.4扩增条件

95℃预变性5min；94℃变性