铁棍山药愈伤组织应对不同真菌侵染的防御机制研究.pdf

摘要

植物在受到病原菌侵染后，会激活复杂多样的防御机制。这些机制涉及到植物细胞

的结构变化、相关抗性代谢途径的激活和基因表达水平的差异。开展植物应答病原菌的

防御机制相关研究，对防治植物病害、提高植物品质和分子育种等方面有重要意义。山

药（Dioscoreaopposite）是薯蓣科薯蓣属多年生缠绕藤本植物，药食两用，具有重要的

经济价值。但因山药长期进行营养繁殖，导致其品种退化、抗性降低，黑斑病、炭疽病

等真菌病害现象明显，给农业生产带来了严重损失。目前有关山药响应真菌侵染的防御

机制研究较少，本研究以豫产道地药材——铁棍山药（D.oppositecv.‘Tiegun’）为研究

对象，使用山药病原真菌（细交链孢霉）和山药内生真菌（青霉菌）侵染山药愈伤组织，

研究了愈伤组织受到侵染后的细胞结构、生理生化特性、防御代谢通路和差异基因表达

的变化。主要获得如下创新性结果：

（1）从铁棍山药黑斑病病害叶片中分离出细交链孢霉（Alternariatenuis），从健

康铁棍山药叶片中内生系统中分离出3株内生真菌，经测序鉴定分别是：青霉菌

（Penicilliumhalotolerans）、枝孢菌（Cladosporiumcladosporioides）和尖孢镰刀菌

（Fusariumoxysporum）。选取A.tenuis和P.halotolerans与愈伤组织共培养120h。结果

表明，A.tenuis菌落完全覆盖愈伤组织，细胞结构皱缩严重，胞内含有大量菌丝，病情

指数达到99.00；P.halotolerans菌落覆盖了2/3的愈伤组织表面，细胞结构轻微皱缩，

组织内含有少量菌丝，病情指数为46.00。结果表明P.halotolerans作为山药内生菌对愈

伤组织的伤害较轻。

（2）A.tenuis和P.halotolerans侵染过程中，愈伤组织的丙二醛（MDA）含量持

续增加，其中A.tenuis处理组的MDA含量积累高于P.halotolerans处理组。该结果表

明相同时间内A.tenuis较P.halotolerans对愈伤组织造成更严重的膜脂过氧化反应。抗

氧化酶系，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT），

呈现先升高后降低的趋势。A.tenuis处理组的SOD、POD和CAT酶活性分别在48h、

36h和36h时达到最大值，分别是对照组的1.35、2.38和2.29倍；P.halotolerans处理

组的SOD和POD活性在72h和36h时达到最大值，是对照组的2.03和2.57倍，但

CAT酶活性在整个侵染过程中一直处于上升状态。该结果表明P.halotolerans作为内生

菌在相同的时间内能够快速调节植物抗氧化酶活性增加，清除活性氧带来的细胞伤害，

减少MDA的积累。

（3）利用同源克隆法从山药基因组中克隆出2条大小约500bp的RGAs，命名为

RGA2和RGA4。对RGAs进行定量分析，结果表明：不同真菌侵染120h内，2个RGAs

表达量均呈现升-降的趋势。A.tenuis处理组中RGA2的表达量于72h时达到最大值，是

对照组的24.94倍；RGA4的表达量于48h时达到最大值，是对照组的30.22倍。在P.

halotolerans处理组内，RGA2的表达量在72h时达到最大值，是对照组的13.91倍；RGA4

的表达量在36h时达到最大值，是对照组的15.70倍。由此推测RGA2和RGA4可能参

与植物抗病防卫过程。

（4）基于不同真菌侵染山药愈伤组织后的抗氧化酶活性和RGA2、RGA4的表达

趋势，选择接种真菌45h后的愈伤组织进行转录组测序分析，共组装得到82,402条

unigene序列。将这些序列与六大数据库（NR，Swiss-prot，Pfam，eggNOG，GO和KEGG）

进行比对，共有44,451条Unigene得到功能注释，占所有组装Unigene的54.38%，其

中注释到的共同显著表达基因有7,740个，对这些基因进