基因工程课件.pptVIP

11.4獲取目的基因的方法11.4.1鳥槍法在基因組DNA文庫中篩選出目的基因鳥槍克隆法在基因組DNA文庫中篩選到的目的基因，與染色體中的天然基因是一樣的，含有內含子，在結構基因兩端的連接區還有轉錄調控序列片段，即調節基因。這樣的基因可供基因表達的調控分析。因為有內含子的存在，這樣獲得的結構基因不宜在原核宿主組織中表達。11.4.2化學合成基因將核著酸或寡核苷酸片段，一個一個地或一片段一片段地縮合起來，成為一個一個基因的核苷酸片段。11.4.3聚合酶鏈式反應polymerasechainreaction，PCR優點很多，具有快速、靈敏、簡便，特異等特點。PCR對DNA範本的品質和數量要求比其他實驗方法低得多但PCR也有缺點：擴增DNA的長度一般不超過2kb，TaqDNA聚合酶在合成作用時也會發生錯誤，出錯率0．25％，費用比較昂貴。基因工程11.1基因工程概述基因工程（geneticengineering），也叫基因操作、遺傳工程，或重組體DNA技術。它是一項將生物的某個基因通過基因載體運送到另一種生物的活性細胞中，並使之無性繁殖（稱之為“克隆”）和行使正常功能（稱之為“表達”），從而創造生物新品種或新物種的遺傳學技術。基因工程概述基因工程的基本流程目的基因獲得重組DNA分子構建導入受體細胞轉化體細胞擴增、鑒定與篩選11.2工具酶11.2.1限制性內切酶識別雙鏈DNA中特定序列並切割雙鏈DNA的核酸內切酶。Ⅰ型和Ⅲ型限制酶的切點不固定，不能產生可以利用的DNA片段，只有Ⅱ型限制酶具有可以控制和預測的位點特異性切割的性質，並且產生固定的DNA片段，因此基因工程中所用的限制酶都是Ⅱ型限制酶。限制性內切酶1II限制性內切酶基本特徵特異性位點切割雙鏈DNA識別序列為4-6個堿基，大多雙重交替對稱切割產生平頭末端(bluntend/flushend)和粘性末端(cohesive)限制性內切酶2EcoRl識別6個核苷酸序列，在特定的G-A之間切割DNA分子：限制性內切酶3BamHⅠ識別6個核苷酸的序列，在特定的A-A之間切割DNA分子限制性內切酶4有少數限制的酶在雙鏈DNA的對稱軸處切割，產生平齊末端（平端），如BalⅠ和SmaⅠ限制性內切酶用途產生特異的限制酶片段；建立DNA分子的限制酶圖譜；構建基因文庫用限制酶切出的相同的粘性末端，以便重組11.2.2.DNA聚合酶DNA聚合酶種類①大腸桿菌聚合酶Ⅰ（全酶）②大腸桿菌聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）③T4噬菌體DNA聚合酶④T7噬菌體聚合酶及經修飾的T7噬菌體聚合酶（測序酶）⑥末端轉移酶⑦逆轉錄酶⑤耐熱DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）DNA聚合酶種類DNA聚合酶用途大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）①用切口平移方法標記DNA（可作雜交探針）②利用其5-3’外切核酸酶活性降解寡核著酸作為合成cDNA第二鏈的引物③用於對DNA分子的3’突出尾進行末端標記，用於DNA序列分析用途Klenow片段①補平限制性內切酶切割DNA產生的3’凹端；②用[32P]補平3’凹端，對DNA片段進行末端標記；③對帶3’突出端的DNA進行末端標記；④在cDNA克隆中，用於合成cDNA第二鏈；⑤在體外誘變中，用於從單鏈範本合成雙鏈DNA；⑥應用雙去氧鏈末端終止法進行DNA測序用途T4噬菌體DNA聚合酶①補平或標記限制性內切酶消化DNA後產生的3’凹端②對帶有3’突出端的DNA分子進行末端標記③標記用作探針的DNA片段④將雙鏈DNA的末端轉化成為平端⑤使結合於單鏈DNA範本上的誘變寡核著酸引物得到延伸用途T7噬菌體DNA聚合酶及由此改造的測序酶①用於拷貝長段範本的引物延伸反應②通過補平或交換（置換）反應進行快速末端標記耐熱DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）①用於DNA測序②用於聚合酶鏈式反應（PCR）對DNA片段進行體外擴增用途末端轉移酶①給載體或CDNA加上互補的同聚尾②用於DNA片段3’末端的放射同位素標記用途11.2.3DNA連接酶T4DNA連接酶①連接帶匹配粘端的DNA分子②雙鏈DNA分子互相連接或合成的接頭相連接11.2.4核酸酶S1核酸酶①去除DNA片段的單鏈突出端，使之成為平端②去除cDNA合成時形成的髮夾結構③施行Sl核酸酶保護試驗（Slprot